Эффект обратимого ингибитора может ослабевать с повышением концентрации субстрата. Такой тип угнетения называют конкурентным. Его отличает то, что в присутствии ингибитора график Михаэлиса-Ментен (рис.
13, а) стремится к тому же пределу (Утах), который наблюдается без ингибитора (кривая 1). Однако достигается этот предел при гораздо более высоких концентрациях субстрата. Соответственно, увеличивается значение константы Михаэлиса, определяемой в присутствии ингибитора (так называемая «кажущаяся» константа Михаэлиса, - Км^аж)- Степень увеличения легко определить, применив способ Лайнуиве- ра-Берка (рис. 4-13, б). Она зависит от концентрации ингибитора ([I]) в среде и от его сродства к данному ферменту, которое оценивается ингибиторной константой К,:
Рис. 4-12. График Лайнуивера-Берка (по экспериментальным точкам, представленным на рис. 4-11).
Из этого соотношения можно рассчитать значение К, (зная использованную в опыте концентрацию ингибитора):
В примере, приведенном на рис. 4-13, значения Км И Км.каж (при расчете их способом Лайнуивера-Берка) равны соответственно -(-1/0,05) = 20 и -(-1/0.28) = 36 мМ (округленно). Поскольку ингибитор в этом эксперименте был использован в концентрации 0,4 мМ, его ингибиторная константа К, составляет 0,5 мМ (расчет приведен на рис. 4-13, б).
Очевидно, что при конкурентном угнетении константа К; характеризует легкость взаимодействия ингибитора не вообще с ферментом. а с его активным центром.
Рис 4-13. Графики Михаэлиса-Ментен (а) и Лайнуивера-Берка (б) для ферментативной реакции без эффекторов (1) и в присутствии 0,4 мМ конкурентного обратимого ингибитора (2).
а) б)
Рис 4-14. Графики Михаэлиса-Ментен (а) и Лайнуивера-Берка (б) для ферментативной реакции без эффекторов (1) и в присутствии 0,4 мМ неконкурентного обратимого ингибитора (2).
В отличие от конкурентных, ингибиторы неконкурентного типа проявляют свое действие вне зависимости от концентрации субстрата. Поэтому максимально возможная скорость реакции в присутствии обратимого ингибитора (Упихоаж) никогда не достигает уровня, наблюдаемого без ингибитора. Вместе с тем, на величине Км неконкурентный ингибитор не сказывается (как это видно на рис. 4-14, а). Иными словами, он не влияет на сродство фермента к субстрату, а лишь снижает его каталитическую эффективность. Поэтому в координатах Лайнуивера-Берка (см. рис. 4-14, б) экстраполяция обеих линий приводит на абсциссе к одной и той же точке (отражающей значение -1/Км), а ординату на более высоком уровне пересекает та прямая, которая проведена по результатам измерений в присутствии ингибитора. Это повышение в обратных координатах свидетельствует, что сама величина Упш.каж меньше, чем тах. Расчеты показывают, что значения этих величин (в данном эксперименте) составляют соответственно 1:0,02 = 50 и 1:0,125 = 80 мкмоль/мии. Зависимость степени этого уменьшения от концентрации неконкурентного ингибитора выражается довольно простым соотношением:
Для расчета величины К, используют обычно уравнение:
В конкретном примере, приведенном на рис. 4-14, она составляет около 0,67 мМ. Это заметно выше, чем величина К} для конкурентного ингибитора, результаты опытов с которым были показаны на рис. 4-13. Значит, из двух исследованных ингибиторов неконкурентный обладает меньшим сродством к изученному ферменту, чем конкурентный.
Таким образом, константа неконкурентного обратимого ингибитора тоже характеризует степень сродства ингибитора к соответствующему ферменту, но уже не к его активному (адсорбционному) центру, а к тому аллостери- ческому участку, с которым взаимодействует неконкурентный ингибитор.
Далеко не всегда действие обратимых ингибиторов бывает чисто конкурентным или строго неконкурентным. Зачастую их действие носит более сложный («смешанный») характер. При этом в присутствии ингибитора изменяются величины И Км, И Упих. Определение степени этих изменений позволяет оценить вклад конкурентного и неконкурентного компонентов в итоговое угнетение фермента.
В сущности, константа обратимого угнетения характеризует положение равновесия в реакции фермента с ингибитором. Выражают ее обычно как константу диссоциации возникающего комплекса Е1, т.е., как отношение произведения концентраций свободных Е и I к концентрации ЕЛ в состоянии равновесия между участниками реакции:
Знание величины К; позволяет сопоставлять эффективность различных веществ. В частности, среди обратимых ингибиторов данного фермента наиболее эффективными («сильными») окажутся те, у которых ингибиторная константа меньше, чем у остальных. С другой стороны, обратимый ингибитор, способный угнетать разные ферменты, будет отдавать предпочтение тому из них, для которого значение Kj наименьшее (если для остальных значения этой константы во много раз больше, то такие ферменты вообще не будут угнетаться в реальных физиологических условиях организма).
Определение значений К* дает еще и возможность по результатам опытов in vitro прогнозировать возможную эффективность испытуемого вещества при введении его в организм (in vivo). Именно такого рода «пробирочные» исследования различных, специально синтезированных веществ совершенно необходимы на ранних этапах работы по созданию любого лекарства нового поколения.
Теперь уже известно, что эффекты лекарственного вещества, как правило, обусловлены его воздействием на ферменты (или на белки, функционально сходные с ними, - например, на клеточные рецепторы). В большинстве случаев это воздействие обратимо. Но самое примечательное заключается в том, что лечебные средства почти всегда являются не активаторами, а ингибиторами ферментов (применительно к рецепторам их обычно называют блокато- рами, невзирая на обратимость действия). Этот парадокс нашел простое объяснение: замедляя некий биохимический процесс, ингибитор способствует более значительному проявлению противоположно направленных реакций. Наиболее яркий пример - кофеин и.близкие ему вещества, содержащиеся в чае, кофе и ряде других растительных экстрактов. Давно замечено, что их прием вызывает состояние, подобное легкому эмоциональному возбуждению, которое, как теперь известно, вызывается «выбросом» в кровь адреналина. Оказалось, что кофеин и подобные ему «тонизирующие» вещества обратимо угнетают фосфодиэстеразу (см. раздел
. Замедляя действие этого фермента, такие ингибиторы способствуют более длительному сохранению молекул цАМФ. Тем самым они имитируют действие адреналина (точнее, обеспечивают более стойкий эффект обычных концентраций адреналина в крови).
