Адсорбционный центр малоспецифичных протеиназ устроен относительно просто. Обычно он предъявляет определенные требования к структуре лишь одной из двух аминокислот, соединенных той пептидной связью, которую способен гидролизовать данный фермент. Это означает, что такая протеиназа в принципе готова расщеплять столько связей в одиом полипептиде, сколько в нем содержится остатков «избранной» аминокислоты (или двух-трех «избранниц», что бывает гораздо чаще).
ПЕРЕВАРИВАНИЕ ПИЩЕВЫХ БЕЛКОВ
Для усвоения организмом пищевых белков необходимо полное расщепление их до мономеров, ибо только свободные аминокислоты легко всасываются в кишечнике, а главное - совершенно лишены антигенных свойств.
Начинается оно в желудке, где пищеварение протекает в сильно кислой среде. Ее создает соляная кислота, вырабатываемая обкладоч- ными клетками желудочных желез (рис. 8-1). Молекулы СОг, поступающие путем диффузии из плазмы крови, подвергаются здесь гидратации до Н2СО3 (эту реакцию сильно ускоряет карбоангидраза). В ходе диссоциации возникшей угольной кислоты появляются ионы Н и НС03, устремляющиеся затем, соответственно, в полость желудка и в плазму крови. При этом бикарбонат транспортируется по анионным каналам в обмен на имеющиеся в плазме ионы хлора, которые далее через хлоридные каналы поступают из клетки в просвет желудка. Протоны отправляются туда же, но другим путем: мембранная Н+/К+-АТФаза выкачивает из клетки ионы Н+, обменивая их на ионы калия, которые затем вместе с упомянутым потоком С1 вновь возвращаются в просвет желудка. В итоге концентрация протонов в желудочном соке возрастает на 6 порядков, обеспечивая его подкисление до pH 1,0-2,0.
Защиту слизистой оболочки от воздействия соляной кислоты (и протеиназ) осуществляют муцины, выделяемые добавочными клет-
ками эпителия желудка. Описание этих высокополимерных гликопротеинов будет приведено в разделе 12.2.1. Здесь же достаточно отметить, что они образуют сильно гидратированную, вязкую слизь, которая устойчива к ферментам и покрывает защитным слоем поверхность не только пищеварительного тракта, но и дыхательных и мочеполовых путей.
Протеолитический компонент желудочного сока вырабатывают главные клетки желез, секретирующие его в виде пепсиногена. Это небольшой одноцепочечный белок, в составе которого активный центр карбоксильной про- теиназы {асп...асп) вполне сформирован, но прикрыт М-концевым фрагментом длиной более 40 АО, содержащим почти все катионные группы молекулы. Воздействие кислой среды (pH ниже 5) стимулирует конформационную перестройку, позволяющую разблокировать активный центр настолько, что он оказывается в состоянии отщеплять от собственной молекулы весь «мешающий» М-концевой фрагмент. Иными словами, реализуется внутримолекулярный процесс аутокатализа (самоактива- ции) протеиназы. Первые же появившиеся таким способом молекулы готового пепсина катализируют превращение новых порций пепсиногена в активную форму.
В период вскармливания материнским молоком в желудочном соке малышей выявляется еще одна протеиназа — химозин (реннин). По строению близкая пепсину, она удаляет короткий гликопептид у одной из цепей главного белка молока - казеиногена. С участием ионов Са2+ измененный белок переходит в нерастворимую форму и осаждается в виде хлопьев (створаживание молока). Тем самым замедляется прохождение жидкой пищи по желудочно- кишечному тракту и обеспечивается более полное ее переваривание.
Соляная кислота желудочного сока не только стимулирует активацию пепсиногена, но и обеспечивает оптимальные для действия пепсина значения pH (1,5-2,5). Вызывая денатурацию натнвных белков пищи, не подвергнутой тепловой обработке, она помогает и их перевариванию (ибо денатурация облегчает доступ ферментов к пептидным связям в глубине белковой молекулы). Кроме того, сильно кислая среда оказывает бактерицидное действие: хотя мы принимаем далеко не стерильную пищу, в содержимом двенадцатиперстной кишки микрофлоры обычно не обнаруживается. Наконец, соляная кислота играет важную роль в регулировании поступления пищевой массы из объемного желудка в довольно узкий просвет кишки. Кислое содержимое желудка, попадая в двенадцатиперстную кишку, вызывает рефлекторное закрытие привратника, и следующая порция может поступить только после нейтрализации предыдущей компонентами панкреатического сока и желчи.
Биохимические методы оценки функционального состояния желудка сводятся в основном к анализу кислотности желудочного сока (в том числе и потому, что в ответ на пищевые стимулы секреция ферментов происходит всегда в большом избытке). Титрованием желудочного сока, извлеченного с помощью зонда, у мужчин натощак выявляется не более 10 мМ свободной НС1, у женщин - менее 6 мМ (базальная свободная кислотность). После стимуляции введением пентагастрина или гистамина концентрация свободной соляной кислоты в желудочном соке в норме резко возрастает, но не превышает 45 мМ у мужчин и 35 мМ - у женщин. Общая же кислотность стимулированного сока (включающая еще и соляную кислоту, связанную катионными группами белков, а также органические кислоты, соли фосфата и т.п.) обычно не выходит за пределы 40-60 мэкв/л.
В соответствии с субстратной специфичностью пепсина (см. ниже), желудочное переваривание приводит не к полному распаду белковых молекул, а лишь к фрагментации на более или менее крупные обломки. В дальнейшем их расщеплении ведущую роль играют панкреатические ферменты; сериновые протеиназы трипсин, химотрипсин, эластаза и Zn -содержащие кар- боксипептидазы. Вырабатываемые поджелудочной железой в виде зимогенов, они переходят в активную форму только в просвете двенадцатиперстной кишки. Инициирует активацию энтерокиназа - крупный (300 кДа) гетероди- мерный гликопротеин, своим трансмембранным доменом фиксированный на энтероцитах. Активный центр этой протеиназы серинового типа обращен в просвет кишки и осуществляет удаление короткого пептида с 1М-конца трипсиноге- на. Этим актом открывается возможность кон- формационной перестройки, ведущей к формированию трехмерной структуры активного центра трипсина.
Энтерокиназа нечувствительна к панкреатическому ингибитору трипсина. Этот небольшой белок (~ 6 кДа) вырабатывается железой в качестве меры защиты на случай аномальной активации трипсиногена по пути его в просвет кишечника.
Будучи активирован энтерокиназой, трипсин, в свою очередь, становится активатором всех панкреатических проферментов. В том числе и новых порций трипсиногена, поступающих с соком поджелудочной железы. Их он преобразует в трипсин так же, как и энтерокиназа, - путем отщепления М-концевого пептида. Аналогичным образом трипсин обеспечивает активацию проэластазы (удаляя короткий пептвд) и прокарбоксипептидазы (у которой отщепляемый N-конец составляет почти четверть молекулы зимогена). Иначе происходит трансформация химотрипсиногена. Серией протеолитических атак его молекула (—250 АО) почти без потерь расчленяется на 3 фрагмента, удерживаемых вместе дисульфидными связями. Протеиназной активностью обладает не только этот конечный продукт (наиболее стабильный), но и все промежуточные, возникающие с первого же воздействия трипсина. Есть, однако, и такой вариант профермента (химо- трипсиноген С), для которого переход в активную форму требует гидролиза трипсином только одной связи (-тарг-вал-), приводящего к удалению 1Ч-концевого экранирующего пептида длиной 13 АО.
Как уже отмечалось в разделе 4.5.2, трипсин гидролизует только те пептидные связи, которые образованы группой -СООН лизина или аргинина Химотрипсин, в отличие от этого, избирателен к связям с участием карбоксильной группы аминокислот, обладающих крупным гидрофобным радикалом (см. рис.
8), а химотрипсин С «добавляет» к числу таких предпочтений еще и метионин н даже глутамин и аспарагин. Пепсин же расщепляет те связи, в которых распознаваемая им аминокислота участвует своей аминогруппой. Иначе говоря, он ориентируется на радикал, обозначенный как К' на рис. 4-8. И в качестве обладателя приемлемого радикала предпочитает лейцин, фенилаланин или тирозин. Хотя фактически его субстратная специфичность гораздо шире. В частности, неожиданным выглядит, что он атакует и связи, образованные группой -СООН глутамата или глутамина.
Наконец, эластаза. Несмотря на структурную близость трипсину и химотрипсину, она единственная способна расшеплять главные белки соединительной ткани - эластин и коллаген. Это обусловлено небольшими особенностями строения адсорбционного центра, благодаря которым доступ к каталитическому участку эластазы получают только аминокислоты с минимальными размерами радикала - глицин, аланин, серии. Ими особенно богаты белки межклеточного вещества. Но и многие другие белки содержат «малые» аминокислоты, а потому тоже гидролизуются панкреатической эластазой.
Таким образом, по своей субстратной специфичности пищеварительные эндопротеиназы не столько дублируют, сколько дополняют друг друга. Действуя на белковую молекулу в любой очередности, они в конечном счете гидролизуют ее до набора некрупных пептидов. Ступенчатое их укорочение осуществляют затем экзопептидазы.
Панкреатические экзопептидазы представлены карбокснпептидазой В, удаляющей с С-конца лизин или аргинин, и карбоксипепти- дазой А, эффективной в отношении незаряженных аминокислот (своеобразная аналогия паре трипсин - химотрипсин!). Сходным образом, но с 1Я~конца действуют и аминопептида- зы кишечного сока, обычно тоже содержащие атом цинка (как и карбоксипептидазы). Одни из них довольно избирательны, другие могут отщеплять почти любую аминокислоту. Завершают тотальный протеолиз в просвете кишки три- и дипептидазы с различной субстратной специфичностью.
Всасывание аминокислот в кишечнике обеспечивается несколькими системами активного транспорта (включая Ыа+-зависимый сим- порт). Они специализированы на переносе либо аминокислот с катионным радикалом (или обязательно анионным), либо обладающих незаряженным радикалом (в зависимости от его размеров, а иногда и других особенностей). Частично всасываемые аминокислоты поступают в лимфу, а остальные - в кровь, с током которой доставляются прежде всего в печень. Небольшая часть продуктов протеолиза может проникать в энтероциты в виде дипептидов и небольших олигопептидов, которые гидролизуются внутриклеточными экзопептидазами различной избирательности.
