Проведен сравнительный анализ содержания IL-1?, IL-6, TNFa, IL-4 в сыворотке крови 67 больных в динамике развития герпетического кератита. Определение уровня цитокинов проведено твердофазным иммуноферментным методом. Показано, что тяжесть герпетического кератита коррелирует с интенсивностью синтеза цитокинов. Более раннее повышение концентрации провос- палительных цитокинов характерно для поверхностных форм герпетического кератита, более позднее и более выраженное — для глубоких. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 4. С. 50-53.)
Известно, что вирус простого герпеса (ВПГ) вызывает до 50 % воспалительных заболеваний роговицы, нередко характеризующихся затяжным и рецидивирующим течением [1, 2, 3]. В процессе первичного инфицирования им человека и реактивации ВПГ в тройничном ганглии он индуцирует нарушения клеточного звена иммунитета, влияет на спектр экспрессии рецепторов на мембране лимфоцитов крови и продукции ци- токинов [4, 9]. Дисбаланс цитокинов является одной из причин утяжеления воспалительного процесса в роговице и развития осложнений, приводящих к слабовидению и слепоте.
Целью настоящего исследования явилось определение уровней ^-1р, ^-6, TNFa, ^-4 в сыворотке крови у больных герпетическим кератитом в динамике заболевания.
Проведено комплексное клинико-иммунологическое обследование 67 больных с герпетическим кератитом (ГК), находившихся на лечении в Уфимском НИИ глазных болезней. В обследовании участвовало 38 мужчин (57 %) и 29 женщин (43 %) от 27 до 62 лет (44,5 в среднем). Обследуемые больные ГК были распределены по клиническим формам в соответствии с классификацией А.А. Каспарова (1994). Среди них с поверхностными формами ГК (древовидный, ландкартообразный, краевой кератиты) 26 (39 %) пациентов, с глубокими (метагерпетический, дисковидный кератоиридо- циклиты, герпетическая язва роговицы с гнойной инфильтрацией) — 41 (61 %).
При постановке диагноза использовали данные анамнеза, клинической картины поражения роговицы и результаты положительного анализа соскоба с конъюнктивы методом флуоресцирующих антител (МФА). Критериями эффективности терапии являлись эпителизация роговицы, рассасывание инфильтратов и повышение остроты зрения. Больным было проведено стандартное противовирусное лечение (местно — мазь зовиракс 3%, внутрь — таблетки ацикловира по 0,2 г
раз в сутки в течение 5-7 дней).
Контрольную группу составили 27 практически здоровых доноров того же возраста. Взятие крови осуществляли натощак из локтевой вены обследуемых в строго стерильных условиях.
Определение уровня интерлейкинов — К-1Р, К-4, ^-6, TNFa в сыворотке крови больных в динамике развития ГК было проведено твердофазным иммуноферментным методом по стандартной методике с использованием тест-систем РгоСоп (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург). Учет результатов проводили с использованием автоматического фотометра «Униплан» при длине волны 450 нм. Результаты выражали в пкг/мл. В норме у здоровых людей содержание К-1Р, К-4, К-6, TNFa в сыворотке крови не превышает 50 пкг/мл.
Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных методов параметрической и непараметрической статистики в рамках программы Stаtsoft Windows 4,0.
Полученные результаты показали, что при поверхностных формах ГК (рис. 1) имеет место достоверное (р < 0,01) повышение среднего уровня ^-1р и TNFa (соответственно 61,3 ± 10,4 пкг/мл и
± 11,3 пкг/мл) в сыворотке крови с 1-го по
й день от начала заболевания по сравнению с контролем (соответственно 34,3 ± 5,6 пкг/мл и
± 9,3 пкг/мл). Содержание ^-1р нормализовалось, начиная с 6-го дня заболевания, продолжая оставаться в пределах нормы до конца наблюдения. Постепенное снижение концентрации TNFa отмечали в течение двух недель, его нормализация происходила только к 16-20-м суткам от начала развития герпетической инфекции глаз.
Концентрация ^-6 была достоверно повышена с 1-го по 15-й дни наблюдения с максимальными значениями (216,5 ± 17,4 пкг/мл) на 6-10-й день. Это в 4,8 раза выше показателей в группе контроля (44,6 ± 7,0 пкг/мл) и в 2,4 раза выше, чем в начале заболевания (91,7 ± 18,6 пкг/мл). В последующие дни уровень ^-6 постепенно нормализовался.
Что касается содержания ^-4, то оно возрастало (97,4 ± 18,1 пкг/мл, р < 0,01) с 11-х суток от начала заболевания и достигало максимальных значений (148,4 ± 14,3 пкг/мл, р < 0,01) на 21-30-е сутки, в 4 раза превышая этот показатель в контроле (37,8 ± 5,8 пкг/мл).
Следовательно, для поверхностных форм ГК в первые 5 дней заболевания характерно выраженное повышение содержания провоспалительных ^-1р и TNFa в сыворотке крови с последующей их нормализацией. Максимальные уровни ^-6 наблюдались на 5 дней позже, чем максимальные уровни ^-1р и TNFa (на 6-10-е сутки). В отличие от провоспалительных цитокинов, наиболее высокие значения противовоспалительного ^-4 отмечали в период ранней реконвалесценции (на 21-30-й день).
При глубоких формах ГК (рис. 3) подъем уровня цитокинов также наблюдали в первые дни заболевания.
Однако в отличие от поверхностных форм, он характеризовался более существенным (р < 0,01) накоплением ^-1р, ^-6 и TNFa в сыворотке крови, причем таким он сохранялся дольше — до 20-30 дней (рис. 2). При этом максимальные уровни ]Ъ-1Р и TNFa (соответственно 101,3 ± 15,2 пкг/мл и 127,5 ± 23,4 пкг/мл, р < 0,01) отмечались на
10-й день, что на 5 дней позже по сравнению с поверхностными ГК. На 11 — 15-й день болезни происходило снижение концентрации этих двух цитокинов и отмечалось максимальное накопление ^-6 (387,5 ± 35,2 пкг/мл), что нашло отражение в обратной корреляционной взаимосвязи между уровнями ^-6 и П|-1Р (г = —0,69, р < 0,01). Нормализация содержания ^-1р и TNFa происходила к 21—30-му дню наблюдения, тогда как ^-6 — только к 31—40-му дню от начала заболевания.
Содержание противовоспалительного ^-4 при глубоких формах ГК, в отличие от поверхностных форм, когда его уровень был высоким с 11-го дня заболевания, повышалось, начиная с 16-го дня, и достигало максимальных значений (186,3 ±26,7 пкг/мл, р < 0,01) только на 31—40 сутки. Наиболее высокое содержание ^-4 у пациентов с глубокими формами ГК наблюдалось в среднем на 10 дней позднее, чем у больных с поверхностными формами.
Итак, сопоставление содержания изучаемых цитокинов с клинической картиной офтальмогерпеса выявило увеличение содержания изучаемых цитокинов в сыворотке крови больных ГК, особенно выраженное при глубоких его формах. Гиперпродукция изучаемых цитокинов, связанная с содержанием субпопуляций лимфоцитов в крови при глубоком поражении роговицы [5, 6], вероятно, является результатом активации антигеном вируса герпеса дендритных клеток.
При обеих формах ГК отмечается одинаковая динамика накопления цитокинов в сыворотке крови, однако увеличение содержания провоспа- лительных цитокинов при глубоком поражении роговицы ВПГ происходит в среднем на 5 дней, а противовоспалительного ^-4 — на 10 дней позже по сравнению с поверхностным, что коррелировало с клиническими особенностями течения ГК. Так, у 24 из 26 (92 %) пациентов с поверхностными формами ГК было отмечено выздоровление на 8—10-е сутки от начала заболевания, продолжительность полной эпителизации роговицы составила в среднем 5,7 ±1,1 дней, рассасывание инфильтратов — 8,2 ±1,5 дней, острота зрения повысилась у 23 (88,5 %) пациентов. Тогда как в группе больных с глубокими формами ГК выздоровление было отмечено у 32 из 41 (78 %) пациента в среднем на 16—20-е сутки (рис. 4). У остальных 9 пациентов выздоровление в более поздние сроки — на 25—30-е сутки — коррелировало (г = 0,67, р < 0,05) с высоким уровнем TNFa и ^-6 на 16—20-е сутки. Эпителизация роговицы наступала в среднем на
± 1,2 день, резорбция инфильтратов заканчивалась к 19,8 ±2,1 дням, признаки иридоциклита исчезали на 17,6 ± 1,6 день, повышение остроты зрения отмечали у 34 (83 %) пациентов.
Высокие значения ^-6 как при поверхностных, так и при глубоких формах ГК сохраняются в течение более продолжительного времени, чем ^-1р и TNFa. Это, вероятно, как и при других вирусных инфекциях [8, 10, 11, 12], связано с ингибирующим действием ^-6 на продукцию провоспалитель- ных цитокинов и подтверждается обратной корреляционной связью содержания П|-1Р и ^-6 при глубоких формах ГК (на 11-15-е сутки от начала заболевания). Более позднее повышение содержа-
пкг/мл
Рис. 1. Содержание цитокинов в сыворотке крови больных в динамике развития поверхностных форм герпетического кератита
Рис. 2. Содержание цитокинов в сыворотке крови больных в динамике развития глубоких форм герпетического кератита
Рис. 4. Больной К. Метагерпетический кератоиридоциклит правого глаза после лечения
ния противовоспалительного ^-4 при глубоких формах ГК по сравнению споверхностными может объясняться ростом продукции №N7 [7], подавляющего его синтез на первых этапах заболевания, и быть причиной углубления воспалительного процесса в роговице.
Вышеизложенное свидетельствует о связи изменений содержания цитокинов в сыворотке крови с динамикой развития ГК и его клинической формой, что открывает новые возможности для иммунодиагностики и разработки эффективной иммунокорригирующей терапии.
Марванова З.Р., Шевчук Н.Е. Продукция цитокинов и оценка тяжести течения герпетических кератитов // Сб. науч. тр. «Актуальные проблемы воспалительных заболеваний глаз». — М., 2001. — С. 193-195.
Носик Н.Н. Цитокины при вирусных инфекциях // Вопр. вирусол. — 2000. — № 1. — С. 4-10.
Шевчук Н.Е. Особенности иммунного ответа при вирусных и хламидийных офтальмоинфекциях. — Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Уфа, 2002. — 22 с.
Biglino A., Sinicco A., Forno B. et al. Serum cytokine profiles in acute primary HIV-1 infection and in infectious mononucleosis // Clin. Immunol.Immuno- pathol. — 1996. — Vol. 78, № 1. — P. 61-69.
Ghanekar S., Zheng L., Logar A. et al. Cytokine expression by human peripheral blood dendiritic cells stimulated in vitro with HIV-1 and herpes simplex virus // J. Immunol. — 1996. — Vol. 157, № 9. — P. 4028-4036
Tilg H., Dinarello C.A., Mier J.W. IL-6 and APPs: anti inflammatory and immunosuppressive mediators // Immunol. Today. — 1997. — Vol. 18, № 9. — P. 428-432.
Serum IL-ip, IL-6, TNFa and IL-4 cytokine content in the course of herpetic keratitis
Data are reported on the content of pro- and anti-inflammatory cytokines in blood serum of 67 patients with ophthalmoherpes. Severity of herpetic keratitis correlated with cytokine production. Epithelial keratitis is characterized by earlier increase in pro-inflammatory cytokines, stromal keratitis — by later and more intensive cytokine increase. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 4. P. 50-53.)
Министерство здравоохранения и социального развития РФ Министерство образования и науки РФ Российская академия наук Российская академия медицинских наук Российская медицинская академия последипломного образования Общероссийский общественный фонд «Здоровье человека»
ЗАО «БиоХимМак»—эксклюзивный дистрибьютор в России и СНГ компании «Biosource»
ЗАО «БиоХимМак» предлагает широкий спектр иммуноферментных тест-систем для количественного определения цитокинов, факторов роста, молекул апоптоза в сыворотке, плазме, супернатанте клеточных культур и других биологических жидкостях человека, крысы, мыши, а также различные рекомбинантные пептиды, антитела компании «Biosource» (Бельгия).
Компания «Biosource» разработала и производит множество антител, специфически распознающих присутствие фосфорилированных остатков, входящих в соответствующие последовательности-мишени исследуемых белков. Использование таких фосфорилированных сайт-специфических антител (phosphorylation site- specific antibodies, PSSAs) позволяет проводить чувствительное и селективное определение сайта/эпитопа фосфорилированного исследуемого белка, который был фосфорилирован по соответствующим специфическим аминокислотным остаткам (то есть по остаткам серина, треонина или тирозина). Использование PSSAs для распознавания индивидуальных мест фосфорилирования дает возможность получения важнейшей информации о селективном и дифференциальном фосфорилировании/дефосфорилировании белка, благодаря которой возможно понимание регуляции отдельного пути сигнальной трансдукции. Кроме того, PSSAs идеально подходят для изучения комплексной модели фосфорегуляции белков, чьи функции регулируются множественными сайтами процесса фосфорилирования, и которые обычно используются клетками для селективной активации различных сигнальных путей.
В настоящее время «Biosource» предлагает широкую панель — более 70 наименований продукции, — предназначенной для анализа фосфорилирования белков, в том числе различных клеточных рецепторов, киназ, фосфатаз, опухолевых супрессоров, факторов трансляции, транскрипции, клеточного цикла и апоптоза.
ЗАО «БиоХимМак» также предлагает наборы для анализа экспрессии генов с использованием различных подходов: мультиплексное детектирование (до 7 генов) методом ПЦР с детекцией в геле, с использованием гибридизации на мембране (несколько сотен генов) или методом ПЦР в реальном времени (десятки генов) единовременно.
пкг/мл
