1 МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского; 2 ММА им. И.М. Сеченова; 3 Медицинский центр «Медстайл-Эффект»;
Отделение онкологии Павлово-Посадской ЦРБ Московской области; 5 ГНЦ «Институт иммунологии» Россздрава РФ;
6 Институт биологии гена РАН, Москва; 7 РГМУ, Москва
При базально-клеточном раке (БКР) встречаются три иммунологических фенотипа: 1) синдром опухолеассоциированного вторичного иммунодефицита с выраженными признаками иммуносупрессии; 2) синдром опухолеассоциированного вторичного иммунодефицита с умеренными признаками иммуносупрессии; 3) синдром опухолеассоциированного вторичного иммунодефицита с аутоиммунными нарушениями. У 82 больных (63 с БКР и 19 с метатипическим раком кожи) с разными иммунологическими фенотипами изучали уровни сывороточных интерлейкинов, TNFa/ ТСрр2, адгезинов, кадхеринов, хемокинов и интерферонов, а также цитокинов ^1- и ^2-лим- фоцитов (всего 31 показатель). Дан анализ возможной патогенетической и клинической роли отдельных сывороточных цитокинов, осуществляющих в организме больного функции врожденного и адаптивного звена противоопухолевого иммунитета, в формировании иммунопатологической картины при различных формах заболевания. Данные могут быть использованы при разработке патогенетически обоснованных алгоритмов дифференциальной диагностики, прогноза и лечения различных вариантов БКР. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 3. С. 21-26.)
На рост эпителиальных образований кожи, в частности базально-клеточного рака (БКР) и его отдельных клинических форм, выраженное супрессивное влияние оказывает иммунная система, осуществляющая функции надзора за опухолевым ростом [6].
При прогрессировании эпителиальных новообразований кожи дерматоонколог неизбежно сталкивается с феноменом опухолезависимой иммуносупрессии, создающей препятствия для эффективной иммунотерапии и ограничивающей лечащего врача в выборе эффективных лечебных средств. Данный феномен имеет плейотропную природу, но в большинстве случаев обусловлен секрецией клетками опухоли цитокинов с имму- носупрессивными свойствами, что имеет место в случае ассоциированного с опухолью вторичного иммунодефицита [10].
Цитокины играют особую роль в канцерогенезе, не только контролируя сложнейшие механизмы наследственного и адаптивного звеньев противоопухолевого иммунитета, но и взаимодействуя с клетками самой опухоли, обеспечивая при этом конкретные сценарии развития злокачественных новообразований, в том числе базалиом кожи [13, 14]. В этой связи изучение цитокинового спектра периферической крови становится одним из стратегических направлений в разработке современных технологий иммунотерапии базалиом.
Целью нашего исследования являлось сравнительное изучение содержания наиболее значимых в патогенетическом отношении семейств цитоки- нов в периферическом кровотоке у больных с ме- татипическим раком кожи и с различными вариантами течения БКР с последующей оценкой клинической ценности вышеуказанных параметров для практики врача-онколога.
Кровь больных с различными клиническими формами БКР и клинически здоровых доноров была получены из МОНИКИ, ММА им. И.М. Сеченова, отделения онкологии Павлово-По-
садской ЦРБ Московской области и медицинского центра «Медстайл-Эффект».
Для исследования были взяты образцы крови 130 человек, 48 из них были клинически здоровые доноры и 82 — пациенты, из которых у 63 был диагностирован базальноклеточный рак (язвенно-нодулярная форма), а у 19 — метатипический рак кожи. Среди больных было 57 мужчин и 73 женщины, возраст больных варьировал от 56 лет до 81 года. Специальному лечению (оперативному или консервативному) ни один из пациентов до окончания обследования не подвергался. Часть пациентов получали лишь наружную терапию (обработка растворами антисептиков при значительных размерах язвенных дефектов).
Все больные были изначально распределены на три клинические группы с гистологически подтвержденными диагнозами БКР или МТР, а именно:
я группа (п = 30): не рецидивирующие язвенные формы БКР с Т^0М0 (диаметр опухоли до 2 см, 1-2 степени изъязвления);
я группа (п = 36): рецидивирующие формы БКР с длительным течением (более 1 года) с характеристикой Т2^0М0 (диаметр опухоли более 2 см, 2-3 степень изъязвления) (п = 17) и МТР с характеристикой Т^0М0 (п = 2);
я группа (п = 16): больные МТР с характеристикой Т2-3 N0М0 и 2-3 степенью изъязвления.
Распределение пациентов по группам (помимо клиникоморфологических особенностей) было обусловлено предварительно полученными данными о нарушении иммунитета по типу синдрома опухолезависимого вторичного иммунодефицита (СОВИД) различной степени выраженности у первых 2 групп пациентов и синдрома опухолезависимого вторичного иммунодефицита с аутоиммунными нарушениями (СОВИДАН) у пациентов третьей группы [2].
Характеристика пациентов по основным критериальным признакам отражена в табл. 1.
Цитокиновый спектр крови оценивали по результатам определения концентрации в периферической крови К-1Р, ^-2, К-4, К-5, К-6, К-7, ^-8, ^-9, ^-10, ^-12, ^-13, ^-15, ^-18 и ^-21,
IFNa и IFNy, эндогенных факторов TNFa и TGFp2, растворимых форм адгезионных молекул ICAM-1, VCAM-1, L- и P-селекти- нов, E- и N-кадхеринов, а также хемокинов CCL2 (MCP-1 — хемоаттрактивный белок моноцитов 1), RANTES и IL-8 с помощью иммуноферментного анализа. Для этих целей применялись коммерческие наборы реагентов отечественного (НПО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург) и зарубежного (Innogenetics, Belgium; Research & Diagnostic Systems, England; Biomar Diagnostics Systems, Germany; Promega, USA, и др.) производства.
Содержание и активность Th1- и Т1і2-кпеток в периферической крови анализировали путем оценки продукции внутриклеточных цитокинов (IL-2 и IFNy в случае Т1і1-клеток и IL-4 в случае Т1і2-клеток) в И4+-лимфоцитах с использованием проточной цитометрии с помощью прибора FACS Calibur™ 3 CS фирмы Beckton-Dickinson (Belgium) [8].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
Соотношение пропорций циркулирующих в крови представителей многочисленного семейства цитокинов имеет не только патогенетический смысл, но и становится важным клиническим критерием для оценки врачом характера течения заболевания.
Результаты исследования содержания цитокинов в периферической крови у пациентов обследуемых групп представлены в таблице 2.
Особенности цитокинового профиля больных базалиомами
Содержание интерлейкинов в сыворотках крови. При СОВИД I тенденцию к снижению проявляли ^-10, ^-7, ^-9, ^-12 и П|-21, при этом максимально низкие значения зарегистрированы для ^-1р и ^-12. Наоборот, тенденция к росту была замечена у ^-4, ^-5, ^-6 и ^-10. Самые высокие значения сывороточных концентраций отмечены у ^-4 и ^-10 (см. табл. 2).
В случаях СОВИДАН тенденцию к снижению, как и в случае СОВИД, демонстрировали ^-7, ^-9 и ^-21, однако здесь минимальные значения зафиксированы для ^-9 и ^-21. Концентрация ^-13 оказалась в 4 раза меньше чем у здоровых доноров. Что касается концентраций ^-1р и ^-12, то в данном случае они оказались повышенными, причем для ^-1р весьма значительно. Значительное повышение концентрации отмечено для ^-5, ^-6, ^-8 (более выраженное, чем при СОВИД I). Содержание ^-10 также оказалось повышено, но не столь значительно, как при СОВИД I. Повышения уровня ^-4 в случае СОВИДАН не наблюдалось.
Ни в случаях СОВИД, ни в случае СОВИДАН не обнаружено видимых сдвигов в сывороточных концентрациях ^-2 и ^-15.
Содержание TNFa и TGFP2 в периферическом кровотоке. Для СОВИД I характерным оказалось снижение концентрации TNFa и TGFP2 (см. табл. 2). В случае СОВИДАН лишь TGFP2 демонстрировал тенденцию к понижению, в то время как для TNFa характерным оказалось значительное повышение концентрации.
Сывороточные концентрации VEGF-1 в случае обоих синдромов (СОВИД I и СОВИДАН) были увеличены.
Содержание адгезионных молекул (адгезинов) в периферической крови. В группе с фенотипом СОВИД I имелась тенденция к снижению содержание в сыворотках крови Е-селектина, Е-кад- херина и VCAM-1 (см. табл. 2). Концентрация sICAM-1 существенно не изменялась.
В группе больных с СОВИДАН концентрация указанных адгезинов, включая sICAM-1, ощутимо уменьшалась.
Концентрации ^кадхерина в случаях СОВИД I и СОВИДАН оказались повышенными, причем в последнем случае более чем в 2 раза.
Содержание хемокинов в сыворотках крови. У больных с СОВИД I значения сывороточных концентраций хемокинов RANTES и ^-8 превышали норму, тогда как МСР-1 сохранялся в границах физиологических колебаний (см. табл. 2).
При СОВИДАН интенсивность роста сывороточных титров RANTES и ^-8 также существенно увеличивалась, причем более выражено, чем при СОВИД I (последний — почти в 2 раза сильнее). МСР-1 же проявлял тенденцию к резкому падению своей концентрации.
Содержание интерферонов в периферическом кровотоке. Как при СОВИД I, так и при СОВИДАН было выявлено понижение концентрации ШГу и ШГа. Но более выраженный характер оно носило при СОВИДАН (для INFy продемонстрировано снижение содержания в сыворотке более чем в 2 раза) (см. табл. 2).
Для больных с иммунологическим вариантом заболевания СОВИД II каких-либо заметных отклонений от значений нормы для тестируемых выше показателей цитокинового спектра крови не обнаружено (см. табл. 2).
Содержание субпопуляций П1- и П2-клеток в крови больных с базалиомами
И у больных с СОВИД (преимущественно с иммунофенотипом I), и у больных с СОВИДАН обнаружено снижение индекса ТЫ/^2, отражающее долевое соотношение в периферическом кровотоке двух особых субпопуляций клеток- хелперов с иммунорегуляторными свойствами (ТЫ- и №2-лимфоцитов) (см. табл. 2).
Основной вклад в снижение данного индекса вносит сокращение размеров субпопуляции ТЫ-лимфоцитов, характерное и для СОВИД, и для СОВИДАН. В случае СОВИДАН, однако, наблюдаемое сокращение провоцируется не только снижением доли ТЫ-клеток, но и возрастанием иммунорегуляторных клеток с фенотипом №2-лимфоцитов.
Особенности цитокиновой архитектоники периферической крови и их клинико-патогенетическая значимость у больных с различными вариантами течения базалиом
Существует два класса Т-хелперов, секретиру- ющих ТЫ- и №2-зависимые интерлейкины. Вырабатываемые ТЫ-лимфоцитами ^-12 и ^N7, а
также TNFа, определяют специфику клеточноопосредованного иммунного ответа, являясь при этом факторами роста, индукторами цитотокси- ческих лимфоцитов (в том числе NK-клеток), индукторами макрофагов. Цитокины. ТЫ играют значительную роль в супресии опухолевого роста. Отмечено, например, что рост концентрации ТЫ-клеток в очаге опухолевой инфильтрации способствует подавлению интенсивности прогрессирования, а в ряде случаев спонтанной регрессии базалиом [14]. ^-12 широко используется сегодня для противоопухолевой терапии, в том числе в комплексном лечении БКР [12].
При СОВИД I, как показано, существенное уменьшение в кровотоке доли ТЫ-клеток сочетается с заметным подавлением секреции ^-12 и IFNy. Более того, наблюдаемая отрицательная динамика отражает, как нами установлено, новый феномен — феномен ассоциативности между гипофункцией оси IL-12/IFNy и падением доли ТЫ-клеток, с одной стороны, и выявленным нами ранее у больных с СОВИД I угнетением функции цитотоксичности, с другой [1].
Установлена также зависимость между сывороточной концентрацией ^-1р, влияющего на индукцию ТЫ- или №2-ответа и низким содержанием циркулирующего в крови пула дендритных клеток (ДК), без которых Т-клеточная активация и Т-клеточный ответ невозможны [1]. Об этом также свидетельствуют данные ряда авторов, отметивших недостаточность функции ДК в обеспечении противоопухолевого иммунитета в связи с низким содержанием в ткани опухоли и около- опухолевом инфильтрате ^-10 [9].
При смене у больных с СОВИД фенотипа 1 на фенотип II (уменьшение степени изъязвления и размеров опухоли) опухоль утрачивает свой инвазивный потенциал и лишается выраженных агрессивных свойств. При этом показатели ТЫ возвращаются к нормальным величинам, пациенты с БКР приобретают значительный ресурс цитотоксичности.
Иная картина наблюдается при смене фенотипа СОВИД на СОВИДАН. Морфологически смена фенотипов характеризуется появлением пула плоскоклеточных структур и в дальнейшем увеличением их удельного количества. Клинически смена иммунологических фенотипов характеризуется следующими признаками: увеличением размеров опухолевого очага (свыше Т2), увеличением степени инвазии и глубины опухолевого дефекта (свыше II степени), образованием подрытых и обрывистых краев опухоли; формированием на поверхности толстой и грубой корки, появлением кровоточивости, образованием плотного инфильтрата и эритемы по периферии язвенного дефекта, появлением зуда и боли в области опухоли [3].
Иммунологически на фоне роста доли №2-кле- ток отмечается тенденция к увеличению №2-за- висимых ^-5 и ^-10 (а также ^-4 и IL-6), фокусирующих свое действие на В-звене иммунитета, активируя пролиферацию и синтез В-клетками антител (в том числе противоопухолевых) [13]. На факт резкой активации секреции ^-5 трансформированными и опухолевыми клетками указывают Т. Lalani et а1., имеющие основания полагать, что совокупное увеличение в крови вышеуказанных цитоки- нов на фоне усиления агрессивных свойств база- лиом связано не только с продукцией цитокинов иммуноцитами, но и с началом продукции ^-4, ^-5 и ^-10 клетками самой опухоли [11].
Сывороточная концентрация ^-6 также увеличивается в несколько раз при смене фенотипов СОВИД на СОВИДАН. Как известно, ^-6 активно способствует формированию канцерогенного потенциала базалиом, подавляя апоптоз опухолевых клеток и одновременно стимулируя процессы ангиогенеза; увеличение содержания ^-6 в тканях опухоли и крови рассматривается авторами как прогностически неблагоприятный признак [7].
Концентрации же ^-13, относящегося к цито- кинам с выраженными противоопухолевыми свойствами, ^-7 и ^-9, продуцируемых керати- ноцитами, клетками базалиомы и рядом других клеток микроокружения опухоли, важных для дифференцировки и активации как цитотокси- ческих клеток, так и пре-В-лимфоцитов, позитивно влияющих и на ^2-ответ и противоопухолевый иммунитет в целом, при СОВИДАН значительно снижены.
Таким образом, дисбаланс в составе ТИ/^2-суб- популяций, имеющий корни во вторичных дефектах цитокинового спектра (в первую очередь, тандемов ^-^/^N7 и П|-5/1Ъ-10), а также концентрации ряда других интерлейкинов, указанных выше, должен учитываться в едином пакете критериальных маркеров при мониторинге больных с ба- залиомами, в том числе на фоне иммунотерапии.
Важную патогенетическую и клиническую значимость имеют и другие интерлейкины.
Содержание большинства адгезионных молекул (адгезинов и селектинов) у больных с базалиома- ми, независимо от клинической формы и фенотипа, заметно снижено, что свидетельствует о недостаточности ресурса в составе адгезинового пула для сохранения стабильности стромальной архитектоники в ходе развития базалиом.
Более определенные доказательства в пользу этого довода получены при анализе профиля кад- херинов. При прогрессии базалиом и смене фенотипа с СОВИД на СОВИДАН уровень сывороточного Е-кадхерина, входящего в семейство мощных супрессоров прогрессии базалиом, заметно уменьшается, а ^кадхерина, участвующего в миграции опухолевых клеток на большие расстояния (метастазировании) за счет взаимодействия со стромой и эндотелием, увеличивается. При определенных условиях на этапе малигнизации происходит замена/переключение синтеза с Е-кадхери- на на ^кадхерин, что в перспективе будет иметь существенное значение для разработки дополнительных иммунологических критериев течения эпителиальных новообразований кожи [5].
Уровни хемокинов П1-8 и RANTES, задействованных в стимуляции процессов ангиогенеза и лимфоцитарной инфильтрации опухолевого очага тучными клетками, и ангиогенного фактора VEGF-1, определяющего состояние проницаемости сосудов и участвующего в метастазировании, также повышались соответственно усилению агрессивных свойств опухоли, а показатели TGFP2, активно участвующего в контроле дифференци- ровки и роста кератиноцитов и принадлежащего к иммуносупрессивным цитокинам, и МСР-1, являющегося аттрактантом для моноцитов и активированных Т-клеток, — снижались.
Дефекты продукции различных цитокинов характерны для канцерогенеза, демонстрируя различную динамику при прогрессии опухолевого роста, в том числе новообразований кожи. Столь выраженная неоднородность в характере дефектов связана с тем, что способностью взаимодействовать с цитокинами обладают не только клетки, обеспечивающие поддержание иммунологического гомеостаза (лимфоциты и др.), но и клетки самой опухоли [13].
Вот почему при онкопроцессе цитокины необходимо рассматривать в качестве составных частей двух взаимодействующих друг с другом систем: 1) иммунокомпетентные клетки — цито- кины; 2) опухолевые клетки — цитокины.
Как правило, в условиях интенсивного опухолевого роста доминирует вторая система, полностью нивелируя противоопухолевый ресурс Т-кле- точных цитокинов [10, 13]. Именно в этом состоит уникальность и заметный негативизм реализации плейотропных эффектов цитокинов при злокачественном росте, и именно в этой связи естественный (наследственный) противоопухолевый иммунитет, будучи слабым, может легко преодолеваться при участии иммуносупрессивных механизмов, к числу которых принадлежат опухолеассоциированные цитокины с иммуносупрессивными свойствами [10]. Механизмы же специфического (адаптивного) противоопухолевого иммунитета с участием, в частности, Т-клеточных цитокинов начинают проявляться лишь при заметном накоплении массы опухоли. Они вносят в контроль за опухолевой массой существенный вклад, но предотвра
тить рост опухоли уже не могут, поскольку основной механизм защиты от опухолевого роста не гуморальный, а клеточный.
Помимо патогенетической значимости цитоки- нов в развитии эпителиальных новообразований, нами продемонстрирована и клиническая ценность определения в соответствующих сочетаниях сывороточных цитокинов, осуществляющих в организме больного функции как наследственного, так и адаптивного звена противоопухолевого иммунитета.
По мнению F. БеПагёеШ, М. Ferrantini, именно репертуар цитокинов является фактором, определяющим характер взаимодействия опухоли со своим микроокружением и системой противоопухолевого иммунитета [4]. Вместе с тем, в условиях активного роста опухоли цитокиновый ресурс во многом остается нереализованным [10]. Опухолевая прогрессия может сопровождаться развитием нарушений на любом из перечисленных выше уровней. Цитокиновая дисрегуляция включает: изменение секреции цитокинов традиционными клетками-продуцентами под влиянием роста опухоли; появление ингибиторов продукции цитоки- нов; появление растворимых форм цитокиновых рецепторов, большинство из которых — ингибиторы функций иммунокомпетентных клеток.
Изучение столь тонких молекулярных инструментов, как цитокины, обеспечивающие кооперативное взаимодействие между адаптивным и наследственным звеньями иммунитета, становится одним из стратегических направлений при создании современных средств и технологий иммуногенодиагностики и иммунотерапии злокачественных новообразований, в том числе базалиом кожи.
ЛИТЕРАТУРА
Снарская Е.С., Дорофеев А.Е., Сучков С.В. и др. Патогенетическая и клиническая значимость особенностей наследственного и адаптивного иммунитета у больных базально-клеточным раком кожи // Росс. ж. кожн. венерич. болезней. — 2005. — № 3. — С. 8-15.
Снарская Е.С., Зубова Ю.Е., Пронина О.Л. и др. Особенности иммунологической реактивности у больных с язвенно-нодулярным типом базально-клеточного и метатипического рака кожи // Физиол. патол. иммунной системы. —
— Т. 5, № 2. — С. 227.
Снарская Е.С. Иммунологические аспекты патогенеза, дифференциальной диагностики и иммунотерапия язвенной разновидности базальноклеточного и метатипического рака кожи. — Дисс. д-ра мед. наук. — Москва,
2005.
BeLardeLLi F., Ferrantini M. Cytokines as a link between innate and adaptive antitumor immunity // Trends Immunol. — 2002. — Vol. 23, № 4. — Р. 201-208.
Cavallaro U., Schaffhauser B., Christofori G. Cadherins and the tumour progression: is it all in a switch? // Cancer Lett. — 2002. — Vol. 176, № 2. — P. 123-128.
Dicker T., Siller G., Saunders N. Molecular and cellular biology of basal cell carcinoma // Australas. J. Dermatol. — 2002. — Vol. 43, № 4. — P. 241-246.
Heinrich P.C., Behrmann I., Haan S. et al. Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation // Biochem. J. — 2003. — Vol. 374, Pt. 1. — P. 1-20.
Hempel G., Galle P.R., Lohr H.F. Quantitative analysis of specific Th1/Th2 helper cell responses and IgG subtype antibodies in interferon-alpha-treated patients with chronic hepatitis C // J. Med. Virol. — 2001. — Vol. 64, № 3. — P. 340-349.
Humphreys T.R., Monteiro M.R., Murphy G.F. Mast cells and dendritic cells in basal cell carcinoma stroma // Dermatol. Surg. — 2000. — Vol. 26, № 3. — P. 200-203; 203-204.
Kupper T.S., Fuhlbrigge R.C. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences // Nat. Rev. Immunol. — 2004. — Vol. 4, № 3. — P. 211-222.
Lalani T., Simmons R.K., Ahmed A.R. Biology of IL-5 in health and disease // Ann. Allergy Asthma Immunol. — 1999. — Vol. 82, № 4. — P. 317-332; 332-333.
Trinchieri G. Function and clinical use of interleukin-12 // Curr. Opin. Hema- tol. — 1997. — Vol. 4, № 1. — P. 59-66.
Wilson J., Balkwill F. The role of cytokines in the epithelial cancer microenvironment // Semin. Cancer Biol. — 2002. — Vol. 12, № 2. — P. 113-120.
Wong D.A., Bishop G.A., Lowes M.A. et al. Cytokine profiles in spontaneously regressing basal cell carcinomas // Br. J. Dermatol. — 2000. — Vol. 143, № 1. — P. 91-98.
Blood cytokine patterns in patients with basal-cell carcinoma: pathogenetic
M.F. Vladimirsky Moscow Region Research Clinical Institute; 2 I.M. Sechenov Moscow Medical Academy;
3 «Medstyle-Effect» Medical Center; 4 Pavlov-Posad Central Regional Hospital, Moscow Region;
National Research Center Institute of Immunology, Ministry of Public Health; 6 Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow; 7 Russian State Medical University, Moscow
Patients with a basal-cell carcinoma (BCC) display three basic immunological phenotypes: (1) tumor- associated secondary immunodeficiency with marked immunosuppression; (2) tumor-associated secondary immunodeficiency with moderate immunosuppression; (3) tumor-associated autoimmune syndrome. The group of 82 patients (63 with BCC, and 19 with metatypical cancer of skin) with various immunological phenotypes were studied. Serum levels of interleukins, TNFa, TGFP2, adhesins, cadherins, chemok- ines and interferones, as well as Th1- and Th2-lymphocyte cytokine patterns (a total of 31 parameters) were analyzed. Pathogenetical and clinical value of individual cytokines for innate and adaptive antitumour immunity is discussed. Potential roles for cytokines in immunopathological changes of various disease forms are considered. The data can be used in development of pathogenetic algorithms of differential diagnosis, prognosis and treatment options for BCC variants. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 3. P. 21-26.)
Key words: basal-cell carcinoma, metatypical cancer of skin, cytokines, innate and adaptive immunity.