загрузка...
 
ЦИТОКИНОВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ И ЭНДОГЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ.
Повернутись до змісту

ЦИТОКИНОВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ И ЭНДОГЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ.

Екатеринбург: УрО РАН, 2006. ISBN 5-7691-1686-2

Один из важнейших механизмов, с помощью которого цитокины управляют самыми разнообразными физиологическими функциями, — регуляция транскрипции генов, экспрессии белков и каталитических активностей различных изоформ цитохром Р450-зави- симых монооксигеназ. Эта уникальная ферментная система осуществляет окислительный метаболизм ли- пофильных соединений и обеспечивает, с одной стороны, биотрансформацию поступающих в организм ксенобиотиков, с другой - биосинтез и биодеградацию стероидных соединений и производных арахидоновой кислоты. Книга посвящена вопросам цитокиновой регуляции биотрансформации ксенобиотиков и эндогенных липофильных сигнальных молекул. Материалы основаны на анализе данных литературы и собственных исследований авторов. Освещается роль цитокинов в регуляции биотрансформации лекарственных препаратов, стероидных гормонов, производных арахидоно- вой кислоты и вклад этих механизмов в регуляцию гомеостаза при воспалении. Авторы посвящают книгу светлой памяти выдающегося иммунолога России профессора Николая Николаевича Кеворкова. Адресована исследователям в различных областях биологии и медицины.

 

Справки о приобретении книги можно получить по телефонам:

8-347-251-71-93; 8-917-34-90-499 Лаборатория иммунофармакологии института иммунологии и физиологии УрО РАН

8-343-374-75-94 Ученый секретарь института иммунологии и физиологии УрО РАН


© Коллектив авторов, 2006

УДК 616.15:616.832-004.2    

Цитотоксическая активность иммуноглобулинов плазмы крови клинически здоровых людей и больных рассеянным склерозом

М.А. Старикович1, Ю.Я. Кит1, М.Я. Хавунка2, Т.И. Негрич2, Р.С. Стойка1

Институт биологии клетки НАН;

Львовский национальный медицинский университет им. Данилы Галицкого, Львов, Украина

Сравнивали действие препаратов иммуноглобулинов (Ig) плазмы крови клинически здоровых доноров и больных легкой и тяжелой формами рассеянного склероза (РС) на жизнеспособность клеточных культур лейкемии человека (Jurkat, MT-4, Namalwa) и мыши (L1210). Установлено, что Ig здоровых доноров обладают значительной цитотоксической активностью (индекс цитотоксичности IC > 50) по отношению ко всем типам исследуемых клеток. Препараты Ig больных РС оказывали разнонаправленное действие на лейкемические клетки в зависимости от типа этих клеток: они были цитотоксичными (IC > 30) по отношению к В-лимфоцитам (Namalwa, L1210) и в ряде случаев стимулировали пролиферацию Т-лимфоцитов (Jurkat, MT-4). Изучение механизма цитотоксической активности Ig с помощью гель-микроэлектрофореза ДНК индивидуальных клеток линии МТ-4 (DNA comet assay) показало, что исследуемые Ig вызывают деградацию ядерной ДНК, характерную для апоптоза. На основании полученных результатов о разнонаправленном влиянии аутологических антител больных РС на выживаемость лимфоцитов сделано предположение

о    индивидуальных различиях в механизмах патогенеза РС у отдельных больных. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 4. С. 26-31.)

Ключевые слова: рассеянный склероз, иммуноглобулины, лимфоциты, цитотоксическая активность, апоптоз.

 

 

 

 

Рассеянный склероз (РС) занимает важное место среди аутоиммунных заболеваний человека, что обусловлено быстрым прогрессированием этого заболевания и ранней инвалидностью больных. РС относят к демиелинизирую- щим заболеваниям, для которых характерно образование склеротических бляшек в головном или спинном мозге, что приводит к развитию неврологических изменений разной степени тяжести [3]. В ЦНС больных РС происходит разрушение белка миелина, и это вызывает де- миелинизацию оболочек аксонов нервных клеток, что, в свою очередь, приводит к ухудшению проводимости нервного импульса [1, 3]. Основной патологический процесс у больных РС протекает в белом веществе головного и спинного мозга, причем развитие этого заболевания сопровождается деструктивными изменениями не только нервных клеток, но и поражением других тканей и органов, что приводит

к системным изменениям в функционировании организма [5, 7].

В последнее время для лечения РС и других аутоиммунных заболеваний начали использовать очищенные препараты иммуноглобулинов (^) крови человека [3, 10, 12]. После инъекции этих препаратов наблюдается значительный клинический эффект, хотя механизмы их действия на иммунную систему еще недостаточно изучены. Не исключено, что препараты ^ влияют на выживаемость и рост аутореактивных иммунных клеток больных РС, и в их организме происходят изменения продукции ^, избирательно действующих на клетки иммунной системы.

Целью работы было исследовать влияние фракций ^, выделенных из плазмы крови здоровых людей и больных РС, на рост в культуре лейкемических В- и Т-лимфоцитов человека и мыши. ^ отдельных больных РС были также проверены на способность индуцировать апоп- тоз Т-клеток.

Материалы и методы

Были обследованы три группы: «К» — клинически здоровые (6 человек — 3 мужчин и 3 женщины в возрасте от 20 до 45 лет), «Л» — 6 больных (2 мужчин и 4 женщины в возрасте от 18 до 47 лет) с легкой степенью тяжести РС с ремиттиру- юще-рецидивирующим типом течения заболевания, и «Т» — 8 больных (3 мужчин и 5 женщин в возрасте от 20 до 50 лет) с тяжелой прогредиентной формой РС. Диагноз РС был поставлен в соответствии с критериями МакДональда (2004) [4]. Все больные состояли на учете в Центре рассеянного склероза при Львовском национальном медицинском университете им. Данилы Галицкого.

Выделение Ig осуществляли по описанной методике [2]. Венозную кровь забирали в присутствии гепарина (конечное разведение 1:100). Для получения плазмы кровь центрифугировали при 500 g в течение 30 мин и выделяли из плазмы препараты Ig 3-кратным переосаждением сульфатом аммония. Для этого к

5 мл плазмы крови добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и осаждали центрифугированием фракцию Ig при 2000 g в течение 10 мин. Осадок растворяли в 250 мкл дистиллированной воды, и осаждение сульфатом аммония повторяли еще два раза, после чего Ig диализовали против фосфатно-солевого буфера (10 мМ Na2HPO4/Na3PO4,

14 М NaCL) на протяжении 18 ч. Концентрацию белка в препаратах определяли по методу Лоури [14]. Белки анализировали электрофорезом в градиенте концентрации (6-17,5%) полиакриламидного геля в присутствии 0,1%-ного додецилсульфата натрия [11]. К препаратам Ig добавляли глицерин (конечная концентрация 20%) (Sigma, USA) и хранили при -20 °С.

В работе использовали клеточные линии, полученные из коллекции Института экспериментальной патологии, онкологии и радиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины (Киев, Украина). Линии МТ-4 и Jurkat — лейкемические Т-лимфоциты человека; линия NamaLwa — В-лимфоциты человека (лим- фома Бэркитта); линия L1210 — лейкемические В-лимфоци- ты мыши. Клетки культивировали во флаконах Карреля в питательной среде RPMI 1640 (Sigma, USA) в присутствии 10% эмбриональной коровьей сыворотки (Sigma, USA), 50 мг/мл ген- тамицина (Sigma, USA) до получения субконфлюентного состояния. Для исследования брали клетки в количестве 1 х 106 в мл, которые высевали в 96-луночный пластиковый планшет. Каждое исследование повторяли трижды. После 2-часовой инкубации клеток в культуральную среду добавляли препараты Ig (конечная концентрация 0,7 мг/мл) на 24 ч. Клетки окрашивали 0,1%-ным водным раствором трипанового синего. Количество живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных) клеток подсчитывали в гемоцитометрической камере под световым микроскопом Биолам Р (ЛОМО, Санкт-Петербург). Индекс жизнеспособности (ИЖ) определяли по формуле:

ИЖ = O/C х 100, где О — количество живых клеток после влияния Ig, С — количество живых клеток в культуре.

Индукцию апоптоза клеток линии МТ-4 препаратами Ig выявляли с помощью гель-микроэлектрофореза индивидуальных клеток (кометный анализ). Для этого клетки МТ-4 инкубировали с разными препаратами Ig, а именно с теми, которые проявляли цитотоксическую активность, или с теми, которые стимулировали рост клеток при указанных выше условиях. Кометный анализ клеток проводили, как описано в работе V. Hurez et aL. [10]. Гель агарозы с клетками после проведения электрофореза окрашивали 0,05%-ным бромистым этидием и фотографировали под флуоресцентным микроскопом МИК МЕД 12 (ЛОМО, Санкт-Петербург) при 200- кратном увеличении.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программы ОгтдтпРго 7.0. Достоверность показателей оценивали по 1-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для исследования было использовано 20 образцов плазмы крови: от 6 клинически здоровых людей (К), 6 больных легкой рецидивной формой РС (Л) и 8 больных тяжелой прогредиентной формой РС (Т). Из венозной крови доноров и пациентов осаждением сульфатом аммония были получены препараты ^, которые, как известно [2], в основном содержат ^ 3 классов: ^О, ^А и ^М. Концентрация белка в полученных нами препаратах существенно не различалась и в среднем составляла 6-8 мг/мл.

С помощью электрофоретического анализа было установлено, что соотношение фракций ^ в плазме крови клинически здоровых людей и больных РС существенно не различается (рис. 1). Поскольку линии лейкемических Т- и В-лимфоци- тов млекопитающих в основном сохраняют структурно-функциональные особенности, характерные для популяции клеток, из которых они происходят, их можно использовать в качестве объекта для исследования функциональной активности лимфоидных клеток млекопитающих.

Сопоставляя средние значения процента выживания разных линий иммунных клеток (рис. 2, Б, Г; рис. 3, Б, Г), можно отметить, что по своему цитотоксическому влиянию на 3 из 4 используемых линий клеток препараты ^ больных РС мало отличаются от препаратов ^ здоровых доноров. В то же время уровень выживания Т- клеток линии МТ-4 в присутствии ^ больных РС статистически превосходил уровень выживания, отмечаемый в присутствии ^ здоровых доноров (см. рис. 3).

 

 

 


Характерной особенностью аутоиммунного заболевания является высокий уровень продукции ^ различных классов, взаимодействующих с антигенами собственного организма (ауто-АТ). Установлено, что ауто-АТ сыворотки крови больных РС взаимодействуют с основным белком миелина и другими белками мозга [18], а также с ДНК млекопитающих [20], фосфолипидами и ганглио- зидами [6, 16]. Ауто-АТ со специфичностью к антигенам клеток мозга могут опсонизировать мие- линовые оболочки нейронов и таким образом индуцировать воспалительный процесс [13]. Они также могут непосредственно гидролизировать основной белок миелина [4, 15]. Показано, что ауто-АТ, выделенные из спинномозговой жидкости больных РС, стимулируют пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови человека [9]. На этом основании можно предположить, что терапевтический эффект препаратов ^ в организме больных РС обусловлен стимуляцией ими клиренса высокоспецифических и низкоспецифических ауто-АТ. В нашей лаборатории проводятся исследования разных форм биоката- литической активности ^ больных РС в сопоставлении с цитотоксической активностью этих ^. Результаты такого исследования будут способствовать раскрытию новых молекулярно-клеточных механизмов патогенеза РС.

Выводы

Препараты иммуноглобулинов (^), выделенных из плазмы крови клинически здоровых людей, обладают цитотоксической активностью по отношению к линиям клеток Т- и В- лимфоцитов лейкемии человека (Jurkat, MT-

Namalwa) и мыши ^1210).

Препараты ^, выделенных из плазмы крови отдельных больных РС, обладают цитотокси- ческой активностью по отношению к лейкеми- ческим В-лимфоцитам (Namalwa, L1210) и, в то же время, способны индуцировать пролиферацию у лейкемических Т-лимфоцитов (Jurkat, MT-4).

Гибель лейкемических Т-клеток линии MT-4 под действием препаратов ^ происходит путем апоптоза.

 

 

 

ЛИТЕРАТУРА

 

 

 

Бойко А.Н., Фаворова О.О. Рассеянный склероз: молекулярные и клеточные механизмы // Мол. биол. — 1995. — Т. 29, № 4. — С. 727-749.

Иммунологические методы: пер. с англ. / Под ред. Г. Фримеля. — М.: Медицина, 1997. — 472 с.

Лисяный Н.И. Иммунология и иммунотерапия рассеянного склероза, Т. 4. — Киев: Изд-во Ин-та нейрохирургии АМН Украины, 2003. — 252 с. — серия «Нейроиммунология».

Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания / Под ред. Е.И. Гусева, И.А. Завалишина, А.А. Бойко. — М.: Миклош, 2004. — 540 с.

Негрич Т.И. Характеристика деструктивных процессов при рассеянном склерозе. — Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. — Харьков, 2004. — 36 с.

Acarin N., Rio J., Fernandez A.L. et al. Different antiganglioside antibody pattern between relapsing-remitting and progressive multiple sclerosis // Acta Neurol. Scand. — 1996. — Vol. 93, № 2-3. — Р. 99-103.

Compston D. The dissemination of multiple sclerosis. The Langdon-Brown lecture 1989 // J. R. Coll. Physicians Lond. — 1990. — Vol. 24, № 3. — Р. 207-218.

Heaton P.R., Ransley R., Charlton C.J. et al. Application of single-cell gel electrophoresis (comet) assay for assessing levels of DNA damage in canine and feline leukocytes // J. Nutr. — 2002. — Vol. 132, № бб, suppl. 2. — P. 1598S-1603S.

Holmoy T., Vandvik B., Vartdal F. T cells from multiple sclerosis patients recognize immunoglobulin G from cerebrospinal fluid // Mult. Scler. — 2003. — Vol. 9, № 3. — Р. 228-234.

Hurez V., Kaveri S.V., Kazatchkine M.D. Normal polyspecific immunoglobulin G (IVIg) in the treatment of autoimmune diseases // J. Autoimmun. — 1993. — Vol. 6, № 6. — Р. 675-681.

Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — Vol. 227, № 5259. — P. 680-685.

Lebrun C., Ghetau G., Bourg V. et al. Intravenous immunoglobulins for relapsing-remitting multiple sclerosis after failure of treatment with other immunomodulators // Rev. Neurol. (Paris). — 2003. — Vol. 159, № 6-7, pt. 1. — P. 648-651.

Lily O., Palace J., Vincent A. Serum autoantibodies to cell surface determinants in multiple sclerosis: a flow cytometric study // Brain. — 2004. — Vol. 127, № 2. — P. 269-279.

Lowry O.H., Rosenbrough H.J., Farr L.A. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. — 1951. — Vol. 193, № 2. — P. 265-270.

Polosukhina D.I., Kanyshkova T.G., Doronin B.M. et al. Hydrolysis of myelin basic protein by polyclonal catalytic IgGs from the sera of patients with multiple sclerosis // J. Cell. Mol. Med. — 2004. — Vol. 8, № 3. — P. 359-368.

Roussel V., Yi F., Jauberteau M.O., Couderq C. et al. Prevalence and clinical significance of anti-phospholipid antibodies in multiple sclerosis: a study of 89 patients // J. Autoimmun. — 2000. — Vol. 14, № 3. — P. 259-265.

Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L. A simple technique for quantitation of DNA damage in individual cells // Exp. Cell Res. — Vol. 175, № 1. — P. 184-191.

Vojdani A., Vojdani E., Cooper E. Antibodies to myelin basic protein, myelin oligodendrocytes peptides, alpha-beta-crystallin, lymphocyte activation and cytokine production in patients with multiple sclerosis // J. Intern. Med. — 2003. — Vol. 254, № 4. — P. 363-374

Wiles C.M., Brown P., Chapel H. et al. Intravenous immunoglobulin in neurological desease: a specialist review // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry.

— Vol. 72, № 4. — P. 440-446.

Williamson R.A., Burgoon M.P., Owens G.P. et al. Anti-DNA antibodies are a major component of the intrathecal B cell response in multiple sclerosis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. — 2001. — Vol. 98, № 4. — P. 1793-1798.

 

 

 

 


Cytotoxic activity of immunoglobulins isolated from blood plasma of healthy donors and multiple sclerosis patients

M.A. Starykovych1, Yu.Ya. Kit1, M.Ya. Khavunka2, T.I. Nehrych2, R.S. Stoika1

Institute of Cell Biology, National Academy of Sciences of Ukraine;

Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Lviv, Ukraine

The effects of immunoglobulin (Ig) preparations isolated from blood plasma of healthy donors and patients diagnosed for mild and severe forms of multiple sclerosis (MS), towards cultured leukemic cells of human (Jurkat, MT-4 and Namalwa lines) and mice (L1210 line) were compared. It was found that Ig of healthy donors possessed high cytotoxic activity (index of cytotoxicity IC > 50) towards all types of studied cells. Preparations of Ig of MS patients differentially affected T and B leukemic cells. They possessed cytotoxicity (IC > 30) towards B leukemic cells (Namalwa and L1210 lines), whereas their cytotoxicity towards T leukemic cells (Jurkat and MT-4 lines) in some cases was absent, and, oppositely, they stimulated proliferation of T cells. Study of the mechanism of cytotoxic activity of Ig by using microgelelectrophoresis of individual cells (DNA comet assay) showed that used Ig caused nuclear DNA degradation characteristic of apoptosis. Thus, the opposite effect of the autological antibodies of some MS patients on lymphocyte survival suggests an existence of considerable differences in the mechanisms of MS pathogenesis in various patients. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 4. P. 27-31.)

Key words: multiple sclerosis, immunoglobulins, lymphocytes, cytotoxic activity, apoptosis.

Уважаемый читатель!

Оформите подписку на получение журнала «Цитокины и воспаление» в 2007 году!

Вопросами оформления подписки занимаются:

Альтернативное агентство подписки «Вся пресса». Узнайте адрес Вашего регионального агентства в Московском межрегиональном агентстве подписки «Вся пресса» по телефону: (495) 234-03-08.

ООО «Интер-почта». Тел. (495) 500-00-60,

Интернет-магазин, (495) 160-58-56, 160-58-48/47, 974-02-09/10, e-mail:

При возникновении вопросов пишите по электронному адресу редакции журнала «Цитокины и воспаление»:

Нейроиммунология

Исследования. Клиника. Диагностика. Лечение

Ежеквартальный научно-практический рецензируемый журнал “Нейроиммунология” издается с 2003 г.

Международный индекс ISSN1724-7434

В журнале публикуются научно-методологические статьи, обзоры литературы, оригинальные исследования, краткие сообщения, клинические наблюдения, случаи из практики по иммунологии, неврологии, сосудистой патологии, психоневрологии, нейроонкоиммунологии, нейроинфекций, эпилептологии, иммунотерапии и т.д., их фундаментальные основы и прикладные клинические аспекты.

В журнале отражена информация о проходящих конференциях по проблемам нейроиммунологии и рассеянного склероза.

Журнал публикует материалы об оценке новых диагностических подходов, методов, препаратах неврологического и иммунологического профиля, предназначенных для лечебно-профилактических целей.

Главный редактор - доктор медицинских наук, профессор Столяров Игорь Дмитриевич

Адрес редакции: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 9, Институт мозга человека РАН. Тел.: (812) 234-68-30, факс: (812) 234-95-18. E-mail:


© Коллектив авторов, 2006 УДК 612.017.1:616-002

 

 

 



загрузка...