СО РАМН, г. Новосибирск КозловИнститут клинической иммунологии По всей вероятности, в настоящее время наступает период осознания неоспоримой важности в клинике основных заболеваний человека проблемы цитокинов. Следует четко себе представлять,что такие клинические киты, как диагностика, патогенез и терапия инфекционных заболеваний,рака, атеросклероза, аутоиммунных заболеваний и др., не могут развиваться без знания роли вкаждом из них отдельно взятого цитокина и/или комплекса цитокинов. Определяя цитокины как биологически активный фактор, необходимо особо подчеркнуть, что они являются продуктами очень многих клеток различных тканей и органов, что они вырабатываются клетками в процессе их жизнедеятельности в ответ на внешние воздействия. Только у отдельных цитокинов синтез носит конститутивный характер. В свою очередь, внешние воздействия следует подразделять на специфические и неспецифические. Под первыми из них — по отношению к иммунной системе — подразумеваются антигенные молекулы, являющиеся индукторами специфического иммунного ответа. Понятие «неспецифичность», вероятно, отражает недостаточность наших знаний, прежде всего о молекулярных механизмах действия цитокинов на объекты мишени. На данном этапе знаний выражение «неспецифическое влияние» обозначает отсутствие данных о возможности одномишенного действия цитокина. Иными словами, каждый цитокин, помимо своего основного, физиологически целенаправленного эффекта (такого, например, как эритропоэзстимулирующее действие у эритропоэтина), обладает способностью влиять на другие, не родственные клеточные элементы и производить регуляторный эффект на их специфическую физиологическую активность (так, например, эритропоэтин подавляет продукцию IL-1 в макрофагах). Являясь ответом на различного рода воздействия, продуцируемые клетками цитокины выступают в роли регуляторов всех основных этапов жизнедеятельности, очевидно, любой клетки организма, модулируя процессы пролиферации, дифференцировки, миграции, специализированного функционирования, апоптоза. Описанные в последние годы механизмы экспрессии генов, участвующих в реализации эффектов факторов роста и цитокинов — при наличии синтеза самих этих факторов в тех же клетках, расширили представления о видах регуляторных механизмов, которыми оперируют в организме биологически активные молекулы — в дополнение к ранее известным: аутокринным и паракринным. Принято считать, что при аутокринной регуляции клетки секретируют растворимый регуляторный фактор, который взаимодействует со специфическими рецепторами, экспрессирующимися на тех же самых клетках. Формируется эффективная аутогенная регуляторная дуга (АРД), где продукт осуществляет механизм обратной связи в отношении клетки, которая его продуцировала. Результатом такого взаимодействия является продолжающийся ответ клетки на внешнее регуляторное воздействие. АРД работает по принципу зависимости эффекта от концентрации внешнего индуцирующего агента, при низкой концентрации которого клетка продуцирует продукт, связывающийся с его собственным рецептором на этой же клетке и тем самым стимулирующий ее пролиферацию. Высокие концентрации того же агента подавляют экспрессию рецепторов к продукту, что обусловливает подавление пролиферации клетки в результате снижения количества рецепторов. Функционирование АРД может реализовыватьсянесколькими путями: через индукцию одного фактора и его взаимодействия с соответствующимирецепторами или через индукцию двух и более факторов и их взаимодействия со своими рецепторами. Своего рода разновидностью аутокринных механизмов являются интракринные механизмы. В этом случае предполагается, что целый ряд цитокинов образуют комплекс белок/рецептор, который быстро интернализуется клетками и транслоцируется в ядро без деградации. По существу, здесь формируется внутриклеточная АРД, требующая наличия биологически активных внутриклеточных рецепторов. Механизмы интракринной регуляции неизвестны, но, возможно, они включают модуляцию репликации ДНК и/или транскрипцию в ответ на проникновение в ядро комплекса белок/рецептор. В некоторых цитокинах определяется последовательность ядерного транспорта в аминотерминальном конце, которая опосредует транспорт этого фактора в ядро. Делеция этого сиквенса определяет вариант фактора без митогенной активности (например, FGFb) при сохранении других его активностей (фосфорилирования тирозина, индукции генов раннего синтеза). Существует и другая терминология для обозначения названных выше видов регуляции: для аутокринного механизма – общественная (public) аутокринная дуга; для интракринного – частная (private) аутокринная дуга. Помимо первых двух видов, предполагается наличие околокринных механизмов, где регуляция осуществляется путем взаимодействия с клеточными рецепторами цитокинов, связанных с мембранами, а не их растворимых форм — с аналогичным конечным эффектом. При этом отсутствие мембраносвязанных цитокинов при наличии их растворимых форм может привести к патологическим последствиям. Мемб раносвязанные формы цитокинов могут быть результатом как неполного процессирования биологически активных прекурсоров секретируемых форм, так и альтернативного сплайсинга. В данном процессе могут принимать участие цитокины, связанные с матриксом. Также предполагается существование механизмов ретрокринной регуляции, которые базируются на взаимодействии растворимых форм рецепторов цитокинов и других молекул, обычно являющихся компонентами клеточной мембраны, с цитокинами и другими лиган дами, расположенными на клеточных мембранах. В основе паракринных механизмов лежит действие цитокинов, продуцированных одними клетками, на другие клетки, расположенные поблизости. Учитывая попадание многих цитокинов в циркуляцию и возможность реализации их действия на клетки многих органов, вероятно, следует говорить также и об эндокринном виде в механизме действия цитокинов. Вряд ли сейчас стоит решать проблему онтогенетического преимущества ауто и интракринных механизмов или около, ретро и паракринных механизмов в регуляции функции какойлибо клеточной популяции, так же, как и их большей или меньшей значимости. Повидимому, следует только быть твердо уверенным в обязательном существовании всех видов регуляторных механизмов в процессе жизнедеятельности любого клеточного элемента. Суммация подобного рода механизмов действует в онтогенезе уже на стадиях образования эктои эндодермы, формирования мезодермы из эктодермы под индуцирующим влиянием эндодермы. Что касается ауто и интракринных механизмов, то, возможно, именно они определяют, с одной стороны, судьбу отдельно взятых клеточных элементов независимо от действия экзогенных регуляторных факторов, с другой стороны, регуляторные эффекты ауто и интракринных факторов во многом будут определять степень чувствительности клеток к действию экзогенных факторов. В литературе выдвигаются предположения о том, что достаточная внутриклеточная активность отдельного цитокина может обусловливать нечувствительность данной клетки к паракринному эффекту того же цитокина. В других случаях аддитивный или синергичный эффект интракринного и паракринного регуляторных механизмов может, очевидно, лежать в основе формирования хронического гиперпролиферативного состояния. Достаточно большое количество цитокинов, открытых и описанных за последние 25–30 лет, а так же ярко выраженная полифункциональность многих из них заставляют уделять пристальное внимание вопросу их систематики, классификации. Особенно это касается цитокинов, участвующих в иммунном ответе и определяющих его величину, формирующих патологические состояния различного генеза. Используемые сейчас понятия: цитокин, фактор роста, лимфокин, монокин, интерлейкин — отображают их клеточное происхождение и отдельные стороны их функциональной активности. Позитивную роль в этом отношении сыграло подразделение отдельных цитокинов на две группы: про и антивоспалительную. Однако, последние определения скорее отображают конечный этап изменения уровня их продукции, когда нарушены механизмы ее регуляции. Если учитывать роль иммунной системы в патогенезе основных заболеваний человека, опираясь на современные знания эффекторных функций иммунной системы в организме, то основа классификации цитокинов, по видимому, должна быть следующей. Необходимо, чтобы она учитывала функционирование основных иммунокомпетентных клеток эффекторов: специфических — антителообразующих клеток и цито токсических Тлимфоцитов (Т киллеров); неспецифических — макрофагов и клеток естественных киллеров. В этом отношении цитокины должны быть разделены на подгруппы, с одной стороны, определяющие формирование клона специфических и активацию неспецифических клеток эффекторов, с другой стороны, отображающие активность последних, являясь продуктами их жизнедеятельности. Отдельную позицию должны занимать цитокины, имеющие отношение к регуляции актив ности полипотентных стволовых кроветворных клеток, которые являются предшественниками для всех иммунокомпетентных клеток. Должны быть рассмотрены и другие рубрикаторы в классификации, предусматривающие плейотропность дей ствия цитокинов и их активное участие во взаимоотношениях между иммунной и другими гомеостатическими системами организма в норме и при патологии. Следует остановиться на некоторых аспектах проблемы цитокинов в клинике. Что касается диагностической значимости определения уровня цитокинов, то здесь трудно найти какой либо яркий пример прямой связи между изменением уровня одного или нескольких цитокинов и какимлибо конкретным заболеванием. Да это, повидимому, вряд ли и возможно, если не будет выявлена болезнь «гена одного цитокина». Скорее всего, диагностическая значимость оценки уровня цитокинов заключается в констатации самого факта повышения или снижения уровня цитокинов у данного больного с конкретным заболеванием, в определении связи этих изменений с течением заболевания, а также в возможном использовании сведений о цитокинах для оценки эффективности проводимого лечения. В настоящее время, когда идет накопление информации по этой проблеме, следует, по возможности, проводить комплексную оценку продукции цитокинов на различных уровнях экспрессии генов и в разных жидкостях и тканях. Необходимо оценивать уровень цитокинов в биологических жидкостях (сыворотка крови, суставная жидкость и т.д.), в культуральной жидкости культивируемых in vitro мононуклеаров крови, бронхиального лаважа и пр. Должен оцениваться уровень как свободного цитокина, так и его связанной формы. Очень важно проводить оценку уровня цитокинблокирующих факторов (специфических ингибиторов, растворимых рецепторов, аутоантител к цитокинам), что подчас дает гораздо больше информации о течении болезни, чем просто уровень самого белка цитокина. Принципиально важным может стать метод оценки экспрессии генов цитокинов по уровню мРНК. Описаны ситуации, когда на фоне сниженной продукции цитокина или даже ее полного отсутствия определяется значительный уровень мРНК, что может свидетельствовать о нарушении определенных механизмов экспрессии гена и это потребует принципиально иных методов коррекции. Проблема диагностической значимости оценки цитокинов очень тесно связана с проблемой определения их роли в патогенезе заболеваний. Пальма первенства в настоящее время здесь принадлежит цитокинам, которые продуцируются, в первую очередь, разными субпопуляциями Тклеток помощников (Th1 и Th2) и которые отвечают за формирование клонов специфических и неспецифических иммунокомпетентных клеток, различающихся по своей эффекторной функции: первые — за активность макрофагов, Ткиллеров, NKклеток, вторые — за антителообразующие клетки. Естественно, надо принимать во внимание некую условность такого разделения, связанную опять же с плейотропностью эффектов большинства цитокинов. По крайне мере, сравнительная оценка содержания цитокинов в этих двух группах также должна проводиться на разных уровнях. Помимо упомянутых выше методов, должна оцениваться продукция цитокинов не только CD4+, но и CD8+клетками, среди которых выделяются две субпопуляции, подобные Th1 и Th2 среди CD4+клеток, т.е. должна проводиться сравнительная оценка. Необходимо оценивать продукцию цитокинов моноцитами/макрофагами, которым принадлежит ведущая роль в индукции ответа к антигенам. Следует думать о такой возможности и в отношении эритробластов, относительный процент которых в костном мозге значительно превышает значения клеток других дифферонов. По данным литературы, эритробласты способны продуцировать целый ряд цитокинов в количестве, по крайней мере, не меньшем чем мононуклеарные клетки. Значительный вклад в проблемные аспекты диагностической значимости оценки цитокинов, определения их роли в патогенезе заболевания вносят и будут вносить данные об аллельных вариантах и изоформах цитокинов, составленные на основе оценки уровня продукции и их биологической активности. Особенно важным представляется определение активности, так как разные варианты и формы цитокинов могут принципиально отличаться друг от друга, вплоть до отсутствия активности, при полной сохранности сродства к соответствующему рецептору на клетках. Благодаря последнему они могут выступать в роли факторов, блокирующих действие биологически активных форм цитокинов. Перспективным направлением в обсуждаемой проблеме представляется определение наличия структур, гомологичных цитокинам, в составе белковой оболочки вирусов, как это показано в отношении вируса оспы и др. Это же касается возможной экспрессии генов гомологов цитокинов в различных микроорганизмах. В обоих случаях это может вносить существенный вклад в дисбаланс цитокинов в организме больного и быть неким определяющим моментом в патогенезе заболевания. Что касается цитокинотерапии, то мы находимся в самом начале решения данной проблемы. Нампредстоит решать вопросы патогенетического обоснования использования цитокинов, выбора дозы, пути введения препарата и продолжительности курса лечения. Необходимо будет обосновывать доказательный выбор между монотерапией и сочетанной терапией цитокинами. В последнем случае это надо будет делать с учетом результирующего эффекта: аддитивности (итог действия двух и более цитокинов будет складываться из суммы каждого из них) или синергизма (итоговый эффект комплекса цитокинов значительно превышает сумму эффектов отдельных факторов). Нельзя будет не учитывать и возможность нивелирующе го эффекта одного цитокина в отношении действия другого. Значительное место в цитокинотерапии займет использование ингибиторов их действия. В настоящее время, например, с позитивным эффектом внедряется в клинику препарат из антител к фактору некроза опухоли. Теоретически весьма перспективным методом терапии представляется использование антисмысловых нуклеотидов. Значительное преимущество последних заключается в высокой специфичности их действия и отсутствии такого лишнего «шума», какой создает, например, комплекс из цитокина и антител к нему, который, несомненно, будет оказывать «постороннее» влияние на иммунную систему и результирующий эффект которого сейчас трудно предсказать. В качестве перспективы цитокинотерапии следует указать на возможность использования цитокинов в роли транспортеров веществ, ингибирующих или активирующих активность клеток мишеней (цитостатиков, ингибиторов или активаторов факторов транскрипции и т.д.). Начаты исследования возможности усиления или снижения активности самих цитокинов с помощью химических субстанций, пришитых к их молекулам. Значительный интерес представляет возможность применения в терапии аллельных и других изоформ цитокинов с большей активностью или с отсутствием таковой. Полученные предварительные данные свидетельствуют о том, что цитокины последнего вида полностью сохраняют сродство к рецепторам. Следовательно, в терапии они могут быть использованы в качестве ингибиторов действия регуляторных молекул. Нет никаких сомнений в том, что для полного понимания механизмов действия цитокинов, необходимого для знания патогенеза заболеваний, для наиболее эффективного их применения в терапии, не обойтись без тщательного изучения механизмов передачи сигнала после взаимодействия с рецепторами и механизмов экспрессии их генов. Принято считать, что гены высших организмов можно подразделять на две основные группы: «гены домашнего хозяйства» (housekeeping genes) и «гены роскоши» (luxury genes). Первые функционируют повсеместно, в процессе всех стадий жизненного цикла организма. Благодаря деятельности продуктов этих генов обеспечиваются такие жизненно основополагающие процессы, как гликолиз, биосинтез аминокислот и нуклеотидов, катаболизм белков и т.д. Вторые экспрессируются в специализированных клетках, являясь своеобразными маркерами их дифференцировочного состояния. Исходя из, возможно, разной биологии этих генов, следует думать о различиях в механизмах регуляции экспрессии генов двух групп, а также в механизмах действия самих продуктов генов. Современные данные позволяют говорить о многоуровневой регуляции экспрессии генов, начиная с активации структуры гена и заканчивая процессом фиксации продукта (цитокина) на специфических рецепторах. Следует четко себе представлять, что на каждом из этапов экспрессии возможны те или иные нарушения механизмов регуляции. Например, одним из важнейших уровней экспрессии генов является образование мРНК. Оказалось, что продолжительность жизни мРНК не является постоянной величиной, а во многом зависит от состояния различных регуляторных механизмов. Имеются данные о том, что увеличение продолжительности жизни мРНК цитокина приводит к увеличению его продукции. Наоборот, уменьшение продолжительности жизни мРНК может обусловливать полную остановку процесса дальнейшей экспрессии гена и отсутствие продукта. Естественно, что это потребует поиска специфических методов воздействия для коррекции указанных нарушений. Тщательному исследованию должны быть подвергнуты механизмы асимметричного деления клеток. Особенно это может касаться полипотентных кроветворных клеток, где с этим процессом связаны механизмы самоподдержания и дифференцировки. Повидимому, существуют внутриклеточные механизмы, определяющие неравномерное распределение по цитоплазме всех ее составляющих, в том числе, вероятно, мРНК цитокинов. Учитывая роль аутокринных механизмов в регуляции активности любой клетки, можно думать и о возможных нарушениях последних, а значит, и о последствиях этих нарушений в результате измененной продукции цитокинов в дочерних клетках. Это пока предположения, но если имеются механизмы, значит, возможны и их нарушения. Высказанное здесь может касаться всех других этапов экспрессии любого из генов цитокина.