Аллельные варианты генов IL-4, IL-10 и TNF? при ВИЧ инфекции М.В. Смольникова , В.Ф. Прокофьев , Л.П. Сизякина , А.Б. Шемшура , И.А. Ольховский , В.И.Коненков
Институт клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск, Ростовский государственный медицинский университет,
Краевой Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями, г. Красноярск.
Изучено распределение аллельных вариантов промоторных участков генов IL 4 (C 590T), IL-10 (C 597A), TNF? (G 308A) у ВИЧ инфицированных пациентов и практически здоровых лиц европеоидного населения России. Методом рестриктного анализа продуктов амплификации выявлены существенные отклонения в распределении генотипов исследованных полиморфизмов у ВИЧ пациентов по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе. Описаны различия между мужчинами и женщинами в распределении генотипов, играющие существенную роль в характере наследования аллельных вариантов генов цитокинов. Изучены ассоциации сочетаний аллелей цитокинов и их генотипов с темпом прогрессирования инфекции при СПИДе. Предполагается, что влияние иммуногенетических факторов на процесс инфицирования может быть связано с различиями в первичной структуре полиморфных промоторных участков генов цитокинов, от которых зависит уровень продукции цитокинов клетками иммунной системы.
У ВИЧинфицированных людей наблюдается дисрегуляция иммунной системы, при которой происходят повреждение Тклеточного звена и сравнительно менее выраженное изменение функционирования Вклеточного звена [4,5,18], отмечаются характерные нарушения содержания цитокинов и функционирования цитокиновой сети [20]. По ряду особенностей развития ВИЧинфекции, изменению количественных и функциональных показателей иммунной системы, характеру клинической картины заболевания различают медленно прогрессирующий (содержание CD4 выше 400?106/л в течение 6 лет и более) и быстро прогрессирующий (содержание CD4 менее 200?106/л в течение 5 лет) варианты течения [17]. При увеличении продукции интерлейкина 4 (IL4) и интерлейкина 10 (IL10) и одновременно сниженном синтезе интерлейкина 2 предполагают, что существенный вклад в прогрессирование СПИДа вносит дисбаланс цитокинов, обусловленный переключением Th1доминантного профиля цитокинов на Th2доминантный [18]. Фактор не кроза опухолиальфа (TNF?) играет особую роль в патогенезе СПИДа, вызывая репликацию виру са иммунодефицита человека и горизонтальное распространение инфекции [6]. Описано in vitro воздействие IL4 и IL10 на репликацию ВИЧ. IL10, наряду с IL12, считают главным иммунорегуляторным цитокином, контролирующим прогрессирование ВИЧинфекции [18].
Описан аллельный полиморфизм генов многих цитокинов, отмечено влияние аллельных вариантов генов на свойства и функционирование белковых продуктов этих генов [7,11]. Отдельные аллельные варианты генов цитокинов ассоциированы с восприимчивостью к аутоиммунным, аллергическим и инфекционным заболеваниям, особенностями и тяжестью их течения, а также с повышенным или, напротив, пониженным содержанием продуцируемых цитокинов [8, 13, 19, 21, 22]. Так, наличие варианта 308А в промоторе генаTNF? ассоциировано с его повышенной продукцией клетками иммунной системы [15], а для гена IL4 описана корреляция 590Т аллеля с повышенной продукцией этого интерлейкина и быстрым прогрессированием ВИЧинфекции [20]. Целью настоящего исследования явилось изучение распределения аллельных вариантов генов IL4, IL10, TNF? у ВИЧинфицированных пациентов, а также анализ возможных ассоциаций определенных генотипов этих цитокинов с вариантами течения и прогрессирования ВИЧинфекции.
Материалы и методы
Обследована группа из 120 ВИЧ-инфицированных больных (35 женщин и 85 мужчин) в возрасте от 16 лет до 51 года, а также группа из 52 практически здоровых лиц (25 женщин и 27 мужчин). В обеих группах были представители фенотипически европеоидного населения России. Высокомолекулярные геномные ДНК выделяли из клеток периферической крови по стандартной методике [12]. Амплификацию участка ДНК, содержащего указанный полиморфизм, осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием последовательностей праймеров (НПО «Вектор») и соответствующих параметров температурных циклов (табл. 1). Реакцию проводили в 20 мкл стандартной реакционной смеси с использованием Taq-ДНК-полимеразы («Сибэнзим», г. Новосибирск).
В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Сибэнзим»). Полиморфизм С-590Т IL-4 типировали с помощью рестриктазы Bsm FI (New England Biolabs Inc, USA), полиморфизм A-597C IL-10 — с помощью Rsa I («Сибэнзим»), по- лиморфизм A-308G TNF? — с помощью Bsp 19I («Сибэнзим»). Рестрикцию продукта амплификации гена IL-4 проводили втечение 6 ч при 65 °С, рестрикцию продуктов IL-10 и TNF? проводили в течение 10–12 ч при 37 °С. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 2 %-ном агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете. Длина ПЦР-продукта гена IL-4 составила 252 пн для варианта Т, длина двух продуктов расщепления Bsm FI в присутствии варианта С — 192 и 60 пн соответственно. Длина ПЦР-продукта гена IL-10 составила 580 пн, длина продуктов расщепления Rsa I в присутствии варианта А — 240, 232, 66 и 42 пн, в присутствии варианта С — 306, 232 и 42 пн. Длина ПЦР-продукта гена TNF? составила 117 пн для варианта A, длина двух продуктов расщепления Bsp 19I в присутствии варианта G — 97 и 20 пн соответственно. Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием показателей относительного риска (RR) — по Woоlf [2], прогностического коэффициента (ПК) — по Гублеру [1], достоверности (р) — по точному методу Фишера [3].
Результаты и обсуждение
У ВИЧинфицированных больных нами найден ряд различий с контрольной группой здоровых людей в частоте сочетаний аллельных вариантов генов цитокинов, связанных с появлением A/A гомозиготного варианта гена IL10 (RR = 2,36), не выявленного у здоровых лиц, и отсутствием гомозиготного A/A варианта гена TNF? (RR = 12,25), обнаруженного у 4 % здоровых женщин. Среди ВИЧинфицированных пациентов T/T генотип гена IL4 встречается почти в четыре раза чаще, чем среди доноров, частота A/G варианта гена TNF? также в четыре раза выше у больных (RR = 4,67) за счет снижения частоты обоих гомозиготных вариантов (табл. 2). У практически здоровых лиц европеоидного населения России нами выявлено преобладание C/C гомозиготного варианта полиморфизма С590Т IL4, что в целом отражает картину распределения генотипов в других европеоидных популяциях, в отличие от монголоидных, где доминирует вариант C/T [10,11,16]. Для полиморфного участка С597А гена IL10 также установлено присущее европеоидам преобладание генотипа C/C, содержание которого у монголоидов существенно снижено [19]. Полученное нами распределение генотипов полиморфизма G308A TNF? отражает закономерности, отмеченные как в европеоидных, так и в монголоидных популяциях [7,9,13,14,23,24], среди которых генотип G/G является преобладающим. Выявлены половые различия в характере распределения генотипов исследованных цитокинов среди ВИЧинфицированных и среди здоровых доноров. У здоровых женщин наблюдается значительное преобладание C/C генотипа IL4, а среди мужчин это различие не столь выражено
Таблица 1 Последовательность праймеров и параметры полимеразной цепной реакции, использованные в исследовании
Таблица 2 Распределение генотипов цитокинов у ВИЧ инфицированных пациентов и у здоровых лиц
Таблица 3 Распределение генотипов цитокинов у ВИЧ инфицированных пациентов и у здоровых лиц в зависимости от пола
Примечание. ** — p ? 0,05 по сравнению с ВИЧ-инфицированными мужчинами.
Таблица 4 Распределение генотипов цитокинов у ВИЧ инфицированных пациентов в зависимости от скорости прогрессирования заболевания
за счет увеличения числа женщин, обладающих редким A/A генотипом. В подгруппе ВИЧинфицированных женщин не выявлено ни одного индивидуума с A/A ге нотипом TNF? (табл. 3). Анализ частоты встречаемости комбинаций аллельных вариантов генов анализируемых цитокинов раздельно в группах мужчин и женщин показал, что с учетом пола пациента можно в ряде случаев получить более высокие значения прогностических коэффициентов, чем в группе пациентов в целом, что индивидуализирует прогноз и повышает уровень его достоверности. Соотношение аллельных вариантов генов оказывает влияние на темп прогрессирования ВИЧинфекции, характеризующегося скоростью перехода заболевания от одной стадии развития к другой. Для благоприятного замедленного варианта течения заболевания характерны более выраженные различия в соотношении генотипов IL4, IL10 и TNF?, тогда как для группы пациентов с быстро прогрессирующим течением характерно более равномерное изменение соотношения аллельных вариантов этих цитокинов (табл. 4). Индивидуальными прогностическими критериями быстрого варианта развития СПИДа являются наличие у больного генотипов, включающих в себя аллель Т (C/T или T/T) для гена IL4, генотипов C/C и A/A для гена IL10 и генотипа A/G для гена TNF?. Рассмотрение сочетаний аллелей исследованных цитокинов выявило преобладание комбинаций вариантов IL4C и TNF?A, а также IL10C и TNF?A у больных с быстрым прогрессированием ВИЧ (RR = 3,3; р = 0,0333 в обоих случаях). При анализе одновременного выявления сочетания исследованных генотипов выяснилось, что комбинация IL4C/C с TNF?G/G у больных с замедленным темпом прогрессирования инфекционного процесса встречается почти в три раза чаще, чем у пациентов с быстро прогрессирующей формой (RR = 2,86; p = 0,0285), тогда как характер распределения сочетания IL10C/C с TNF?A/G имеет обратную направленность (RR = 4,35; p = 0,0127). Следует отметить, что распределение генотипов C/C и C/T полиморфизма С590Т гена IL4 и генотипов G/G и A/G полиморфизма G308A гена TNF? у больных с медленным прогрессированием ВИЧинфекции ближе к таковому у здоровых лиц, чем у больных с быстрым развитием процесса. Использование расчета суммарного прогностического коэффициента для прогноза предрасположенности к развитию ВИЧинфекции по анализу трех полиморфизмов генов цитокинов IL4, IL10 и TNF? c учетом пола для мужчин может составить величину 14,1, что соответствует 96 %ной вероятности реализации прогноза, а для женщин— 12,5 (92 %). Использование такого подхода для прогноза развития неблагоприятного быстро прогрессирующего варианта ВИЧинфекции может составить величину 7,1, что соответствует 65 %ной вероятности его реализации. Можно предположить, что расширение числа анализируемых полиморфизмов может увеличить достоверность прогноза до приемлемой в клинике величины 99 %. Таким образом, среди ВИЧинфицированных наблюдаются достоверные различия в характере распределения комбинаций аллельных вариантов генов ключевых цитокинов, что связано с полом пациента и характером течения заболевания. При случайном характере контакта человека с вирусом эти данные свидетельствуют о том, что на процесс инфицирования существенное влияние оказывают иммуногенетические факторы, определяющие либо состояние естественной резистентности к проникновению вируса в иммунную систему человека, либо, напротив, создающие условия для длительной персистенции вируса в лимфоидных клетках. Вероятно, это может быть связано с тем существенным влиянием, которое оказывает первичная структура полиморфных промоторных участков генов цитокинов на уровень продукции цитокинов клетками иммунной системы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гублер Е.В. Информатика в патологии, клинической медицине и педиатрии.— Л.: Медицина, 1990. — C. 176.
2. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика. — М.: Медицина, 1983. — C. 208.
3. Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа, 1990. — C. 352.
4. Хаитов Р.М., Османов С.К. Иммунопатогенез ВИЧ-инфекции и иммунология СПИДа // Иммунология. — 1991. — № 2. — С. 4–12.
5. Хаитов Р.М., Чувиров Г.Н. Иммунопатологические аспекты ВИЧ-инфекции и СПИДа // Иммунология. — 1994. — № 5. — С. 6–12.
6. Халдеева В.А., Калинина Н.М., Рахманова А.Г. и др. Спонтанная и индуцированная продукция ФНО-a у детей с ВИЧ-инфекцией // Иммунология. — 1995. — № 2. — С. 16–18.
7. Arias A.I., Giles B., Eiermann T.H. et al. TNF-? gene polymorphism in psoriasis // Exp. Clin. Immunogenetic. — 1997. — Vol. 14. — P. 118–122.
8. Bidwell J., Keen L., Gallageher G. et al. Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases // Genes and Immunity. — 1999. — Vol. 1.— P. 3–19.
9. Brinkman B.M.N., Huizinga T.W.T., Kurban S.S. et al. Tumor necrosis factoralpha gene polymorphism in RA: association with susceptibility to, or severity of, disease? // Brit. J. Rheumatol. — 1997. — Vol. 36. — P. 516–521.
10. Burchard E.G., Silverman E.K., Rosenwasser L.J. et al. Association between a sequence variant in the IL-4 gene promoter and FEV1 in asthma // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 1999. — Vol. 160. — P. 919–922.
11. Cantagrel A., Navaux F., Loubet-Lessonlie P. et al. IL-1beta, IL-1 receptor an- tagonist, IL-4, and IL-10 gene polymorphisms // Arthritis and Rheumatism.— 1999. — Vol. 42, № 6. — P. 1093–1100.
12. Dyer P., Middleton D. Histocompatiblity testing. — New York, 1993. — P. 113–114.
13. Fernandez-Arquero M., Anoyo R., Rubio A. et al. Primary association of a TNF gene polymorphism with susceptibility to MS // Neurology. — 1999. — Vol. 53, № 6. — P. 333.
14. Hohler T., Schaper T., Schneider P.M. et al. Association of different TNF-? promoter allele frequencies with ankylosing spondylitis in HLA-B27 positive individuals // Arthritis and Rheumatism. — 1998. — Vol. 41, № 8. — P. 1489–1493.
15. Hutchinson I.V., Pravica V., Hajeer A., Sinnott P.J. Identification of high and low responders to allografts // Rev. Immunogenetics. — 1999. — Vol. 1. — P. 323–333.
16. Kanemitsu S., Takabayashi A., Sasaki Y. et al. Association of IL-4 receptor and IL-4 promoter gene polymorphisms with SLE // Arthritis and Rheumatism. — 1999. — Vol. 42, № 6. — P. 1298–1300.
17. Khoo S.H., Pepper L., Snowden N. et al. TNF c2 microsatellite allele is associ- ated with the rate of HIV disease progression // AIDS. — 1997. — Vol. 11, № 4. — P. 423–428.
18. Lucey D.R., Clerici M., Shearer G.M. Type 1 and type 2 cytokine dysregulation in human infectious, neoplastic, and inflammatory diseases // Clin. Microbiol. Rev. — 1996. — Vol. 9, № 4. — P. 532–562.
19. Mok C.C., Lanchbury J.S., Chan D.W., Lau C.S. IL-10 promoter polymorphism in Southern Chinese patients with SLE // Arthritis and Rheumatism. — 1998. — Vol. 41, № 6. — P. 1090–1095.
20. Nakayama E.E., Hoshino Y., Xin X. et al. Polymorphism in the interleukin-4 promoter affects acquisition of human immunodeficiency virus type 1 syncytiuminducing phenotype // J. Virology. — 2000. — Vol. 74, № 12. — P. 5452–5459.
21. Patino-Garcia A., Sotillo-Pineiro E., Modesto C. et al. Screening of the Tumor Necrosis Factor-Alpha gene Promoter Polymorphisms by PCR-DGGE analysis // Mutation Research Genomics. — 1999. — Vol. 406. — P. 121–125.
22. Turner D.M., Williams D.M., Sankaran D. et al. An investigation of polymorphism in the IL-10 gene promoter // Eur. J. Immunogenet. — 1997. — Vol. 24, № 1.— P. 1–8.
23. Walston J., Siebert M., Yen C-J. et al. TNF-alpha238 and -308 polymorphisms do not associate with traits related to obesity and insulin resistence // Diabe- tes. — 1999. — Vol. 48. — P. 333.
24. Yoshida A., Ishii A., Leafasia J.L. et al. Polymorphism of the TNF? gene in Melanesian and East- Asian populations // Immunogenetics. — 1998. — Vol. 47. — P. 497–498.
Allelic variants of IL 4, IL-10 and TNF? genes in HIV infection M.V. Smolnikova , V.F. Prokofev , L.P. Sizyakina , A.B. Shemshura I.A. Olhovskiy , V.I. Konenkov
Institute of Clinical Immunology of SB RAMS, Novosibirsk
Rostov State Medical University
Regional Center for AIDS and Infectious Deseases Prevention and Treatment, Krasnoyarsk.
The aim of the study, performed by means of amplification products restrict analysis, was to investigate the distribution of allelic variants of genes promotor loci IL 4 (C 590T), IL-10(C597A), TNF ? (G308A) in HIV infected patients and healthy individuals of Caucasoid population in Russia. In comparison to controls, HIV infected patients demonstrated a number of considerable deviations of genotypes distribution. In men and women of both groups different genotypes distribution was found. Thus, gender related differencies may influence the inheritance of cytokines genes allelic variants. The linking of examined cytokines alleles and their genotypes as well as their associations with the rate of AIDS infection development were analyzed. Thus, immune genetic factors can influence the infection development. This fact can be due to differences in initial structure of cytokines genes promotor loci polymorphism. The last one determines the level of regulatory factors production in immune system cells.
