Способность иммунокомпетентных клеток периферической крови больных ревматоидным артритом и системной красной волчанкой к синтезу цитокинов с про и противовоспалительными функциями — IL-1?, TNF?, IL-6, IFN? и IL-10 Т.В. Глазанова , Л.Н. Бубнова , В.И. Мазуров
Способность иммунокомпетентных клеток периферической крови больных ревматоидным артритом и системной красной волчанкой к синтезу цитокинов с про и противовоспалительными функциями — IL-1?, TNF?, IL-6, IFN? и IL-10 Т.В. Глазанова , Л.Н. Бубнова , В.И. Мазуров
Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, СанктПетербург,
СанктПетербургская медицинская академия последипломного образования
С целью установления роли провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в поддержании аутоиммунного процесса системного характера у 48 больных ревматоидным артритом (РА) и 32 больных системной красной волчанкой (СКВ) I–III степеней активности в стадии развернутых клинических проявлений были изучены особенности синтеза IL?1?, IL?6, TNF?, IFN? и IL?10 лимфоидными клетками периферической крови. Установлено значительное повышение способности иммунокомпетентных клеток больных РА и СКВ к спонтанной продукции IL?6 и TNF?, наряду с возрастанием уровня IL?10 в сыворотке крови. При этом спонтанная продукция IL?1? была повышена незначительно, а IFN? — не отличалась от нормы. Продукция IL?6 у больных СКВ возрастала параллельно с увеличением степени активности иммуновоспалительного процесса, в том числе, с возрастанием содержания С?реактивного белка, и была значительно выше у пациентов с II и III степенями активности по сравнению с пациентами с СКВ I степени активности. Таким образом, РА и СКВ на этапе развернутых клинических проявлений характеризуются дисбалансом цитокинов с провоспалительными и противовоспалительными функциями, способствующим поддержанию каскада иммуновоспалительных реакций, а также — доминированием Т?хелперов 2?го типа, продукты которых — IL?6 и IL?10 — способствуют стимуляции аутоантителообразования.
Перечисленные особенности продукции цитокинов играют патогенетическую роль в поддержании аутоиммунного процесса на этапе клинической манифестации системных аутоимунных заболеваний. Ключевые слова: цитокины, ревматоидный артрит, системная красная волчанка. Как правило, локальная и системная продукция цитокинов приводит к большинству патологических последствий при аутоиммунных заболеваниях (АИЗ). Хотя почти все цитокины участвуют в воспалительном процессе при системных аутоиммунных заболеваниях, некоторые из них, такие, как: IL-1?, TNF?, IL-6, и IFN? — играют наиболее важную роль в патогенезе ревматоидного артрита (РА) и системной красной волчанки (СКВ). В литературе существуют различные мнения о преобладании того или иного типа цитокинов — продуктов Тхелперов 1 или 2го типов (Th1 и Th2) при системных АИЗ. Отчасти это многообразие мнений и данных обусловленотем, что разные исследователи изучали пациентов на различных этапах развития заболевания. Кроме того, большая часть исследований посвящена изучению выработки цитокинов непосредственно в месте поражения: клетками, выстилающими полость сустава, эндотелиальными клетками. Следует также отметить, что изучение уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке крови позволяет судить лишь о совокупной активности лимфоидных клеток продуцентов и моноцитов/макрофагов, а также клеток эндотелия и ряда других, чьи функции активизируются при аутоиммунном процессе. Целью нашей работы было изучение особенностей синтеза провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (IL-1?, IL-6, TNF?, IFN?, и IL-10) у больных РА и СКВ в стадии развернутых клинических проявлений для установления роли этих цитокинов в поддержании аутоиммунного процесса системного характера.
Материалы и методы
Были обследованы пациенты с серопозитивным РА и СКВ, находившиеся на лечении в Городском ревматологическом центре СанктПетербурга. Группа больных РА I–III степеней активности состояла из 48 человек с длительностью заболевания 9,2 ± 1,1 года, среди которых женщин было 70,8 %, мужчин — 29,2 %; возраст больных колебался от 39 до 78 лет (в среднем — 56,4 ± 1,3 года). Большая часть (82,9 %) больных РА получала базисную цитостатическую терапию метотрексатом в дозе 5–10 мг/нед. и один из нестероидных противовоспалительных препаратов. Группа больных СКВ I–III степеней активности в фазе обострения состояла из 32 человек с длительностью заболевания 8,0 ± 1,3 года; 90,6 % обследованной группы составили женщины, возраст больных колебался от 21 года до 67 лет (с среднем — 41,8 ± 2,1 года). Терапию преднизолоном в дозах от 5 до 60 мг/сут. проводили в подавляющем большинстве (93,5 %) случаев. В контрольную группу для иммунологических исследований вошли 35 практически здоровых людей в возрасте от 22 до 65 лет. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли в стерильных условиях на градиенте плотности Lymphoprep (Sigma), ? = 1,077, трижды отмывали и культивировали в течение 24 ч при 37 °С и 5 % СО2в 96 луночных планшетах, в количестве 2?105на лунку. Для культивирования использовали среду RPMI1640 («Биолот», СанктПетербург) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», СанктПетербург) и 80 мкг/мл гентамицина. Мононуклеары культивировали как в присутствии индуктора (стимулированная продукция), так и без него (спонтанная продукция). В качестве индуктора синтеза TNF? и IL-1? использовали раствор пирогенала (липополисахарид Pseudomonas aeruginosa; ЛПС) в дозе 0,1 мкг/лунку. В качестве индуктора синтеза IL-6 использовали фитогемагглютинин (ФГА) в дозе 10 мкг/лунку. Все пробы ставили в триплетах. Собранные после завершения культивирования супернатанты собирали и исследовали на наличие цитокинов методом иммуноферментного анализа.
Для определения TNF?, IL-1? и IL-6 использовали тестсистемы фирмы «Протеиновый контур» (ГНЦ НИИ ОЧБ, СанктПетербург), для определения IFN? — тестсистемы «Цитокин» (ГНЦ НИИ ОЧБ, СанктПетербург), для определения IL-10 — тестсистемы «R&D Systems» (США).
Результаты и обсуждение
Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что способность иммунокомпетентных клеток спонтанно вырабатывать IL-6 в группах пациентов с РА и СКВ была значительно повышена, тогда как ФГАиндуцированная активность продукции IL-6 оказалась в пределах нормальных величин. При этом индекс стимуляции, показывающий, во сколько раз усиливается цитокинпродуцирующая активность клеток в ответ на стимулятор, был значительно снижен и составил соответственно 2,7 ± 0,3 и 5,9 ± 1,2 при норме 50,1 ± 20,7. Это свидетельствует, вопервых, о наличии предсуществующей активации иммунокомпетентных клеток, приводящей к усилению их способности спонтанно вырабатывать IL-6, и, вовторых, о снижении их реактивности, что выражается в нарушении способности реагировать усилением выработки цитокина в ответ на неспецифический стимул. Являясь провоспалительным цитокином, IL-6 регулирует синтез и секрецию гепатоцитами белков острой фазы, в частности, С-реактивного белка (CRP) [1, 2]. Действие IL-6 на функции нормальных В-клеток сводится к стимуляции их дифференцировки в антителопродуцирующие клетки, что может иметь патогенетическое значение, так как способствует продукции ревматоидного фактора и развитию гипергаммаглобулинемии. Способность мононуклеарных клеток больных РА и СКВ к спонтанной продукции TNF? была также значительно (в несколько раз) повышена по сравнению с нормальными значениями. В то же время, ЛПС-индуцированная способность продуцировать данный цитокин в изученных группах больных оказалась значительно сниженной по сравнению с соответствующим показателем у здоровых лиц. Снижены также были и индексы стимуляции, они составили соответственно 1,7 ± 0,1 и 1,8 ± 0,1 в группах пациентов с РА и СКВ при норме 53,7 ± 11,5 (p < 0,001). Что касается IL-1?, то его спонтанная продукция периферическими мононуклеарными клетками
Таблица 1 Способность лимфоидных клеток периферической крови больных ревматоидным артритом (РА) и системной красной волчанкой (СКВ) к продукции цитокинов
пациентов с РА и СКВ лишь незначительно превышала нормальные показатели, хотя продукция этого цитокина в ответ на стимуляцию ЛПС оказалась также сниженной в 10,2 и 8,3 раза соответственно по сравнению с группой здоровых лиц. Индексы стимуляции были тоже значительно ниже нормальных значений и составили в группах больных РА и СКВ соответственно 2,4 ± 0,2 и 2,6 ± 0,4 при норме 35,5 ± 5,9. Согласно данным литературы, при РА цитотоксические Тклетки, продуцирующие TNF?, накапливаются в поврежденных суставах, где они могут играть патогенетическую роль, причем их содержание в синовиальной жидкости выше, чем в периферической крови [11]. Усиленная продукция TNF? отчасти является причиной поддержания воспалительного процесса и определяет его тяжесть. Среди прочих эффектов, TNF? индуцирует резорбцию костной ткани, активируя остеокласты и ингибируя синтез коллагена в костях. Известно, что TNF? и IL-1? ингибируют апоптоз синовиальных клеток, что также вносит вклад в пролиферативные процессы и деструкцию пораженных суставов и тканей при РА и СКВ [8, 14].
По данным K. Sun et al. [12], синтез TNF? при СКВ может стимулироваться антиДНКантителами. Кроме того, IL-1 и TNF? индуцируют продукцию IL-6, который, в свою очередь, усугубляет местную деструкцию тканей сустава, усиливая продукцию ревматоидного фактора и индуцируя синтез белков острой фазы, уровень которых является достоверным маркером активности процесса при системных АИЗ. Полученные нами данные о повышении способности периферических мононуклеарных клеток к спонтанной продукции TNF? и IL-6 при РА и СКВ подтверждают перечисленные факты. Важность роли IL-1? в развитии системных аутоиммунных заболеваний не вызывает сомнений. Известно, что в качестве медиатора воспаления IL-1? способен опосредовать развитие системного острофазного ответа. В то же время, обнаруженное нами отсутствие выраженного повышения спонтанной продукции данного цитокина периферическими лимфоидными клетками у больных РА и СКВ может быть обусловлено тем, что основными его продуцентами являются моноциты и тканевые макрофаги, синовиоциты, фибробласты и эндотелиальные клетки. Вероятно, способность иммунокомпететных клеток периферической крови к спонтанному синтезу данного цитокина не столь изменена, что находит отражение и в работах других исследователей [13]. Показано, что продукция IL-1 может быть даже снижена по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе, тогда как высвобождение рецепторного антагониста IL-1 остается нормальным [5]. Существуют также данные о том, что отсутствие необходимого сигнала для активации Тклеток при СКВ обусловлено недостаточной продукцией акцессорными клетками необходимого для этого процесса IL-1 [3].
Как известно, IL-10 является противовоспалительным цитокином, продуктом преимущественно Th2клеток, ингибирующим функции Th1клеток. Сывороточный уровень IL-10 в обследованной группе пациентов с РА колебался в пределах от 4 до 500 пг/мл и в среднем был значительно повышен (см. табл. 1). У пациентов с СКВ уровень IL-10 также достоверно превышал нормальные показатели, при этом у 50 % обследованных больных его содержание было выше 100 пг/мл, у 31,3 %— составляло от 10 до 100 пг/мл и лишь у 18,7 % больных СКВ не превышало нормальных значений. Являясь сильным активатором Вклеток, IL-10 может повышать их жизнеспособность, ингибируя процессы апоптоза и играя роль в патогенезе СКВ и РА [7]. Гиперактивность Вклеток является ключевым аспектом патогенеза СКВ, и обусловленная ею гипергаммаглобулинемия является IL-10зависимой, а по некоторым данным, и IL-6зависимой [6]. Кроме того, выработка IL-1, IL-6 и IL-10 может индуцироваться иммунными комплексами (ИК), уровень которых значительно повышен при системных АИЗ; а TNF?, являясь сильным индуктором продукции IL-1, также способствует выработке данного цитокина клетками крови в присутствии ИК в пороговых дозах. Это свидетельствует о том, что индукция интерлейкинов способствует реализации патологического воздействия иммунных комплексов на организм [4]. Изучение способности мононуклеарных клеток к спонтанной продукции IFN?, синтезируемого, как известно, Тхелперами 1го типа, при РА и СКВ не показало значимых отличий от нормы в обеих группах больных.
Таким образом, учитывая полученные нами данные о значительном возрастании синтеза продуктов Th2клеток — IL-6 и IL-10 — на фоне неизмененной продукции IFN?, можно сделать вывод, что на этапе развернутых клинических проявлений как РА, так и СКВ имеет место сдвиг в сторону доминирования активности Th2клеток. По мнению A. Mongan et al. [9], одновременное повышение уровня IL-10, продукции IL-6 и TNF? при СКВ может объясняться дефектом супрессии синтеза провоспалительных цитокинов, вызываемой IL-10, и приводить к поликлональной активации Вклеток, наблюдаемой при этом заболевании. Согласно классификации СКВ по В.А. Насоновой (1972), степень активности СКВ (I — минимальная, II — умеренная, III — высокая) определяют в соответствии с выраженностью клинических симптомов и уровнем лабораторных показателей, таких как: ?глобулины, фибриноген, сиаловые кислоты, Среактивный белок, ревматоидный фактор
Таблица 2 Основные лабораторные показатели в группах больных системной красной волчанкой различной степени активности
Примечание. В скобках — частота встречаемости, %. CRP — С реактивный белок; АНФ — антинуклеарный фактор.
LEклетки, антитела к нативной ДНК, антинуклеарный фактор (АНФ), активность комплемента и ряда других. При подразделении обследованных больных СКВ по степени активности процесса и, соответственно, выраженности лабораторной симптоматики, больные СКВ распределились на три равные группы — с I, II и III степенями активности. Основные лабораторные показатели, между которыми наблюдались различия в выделенных группах, представлены в табл. 2. Как следует из приведенных данных, наряду с возрастанием содержания CRP, ревматоидного фактора, LE-клеток и АНФ, отмечавшегося параллельно с увеличением степени активности процесса, способность к спонтанной продукции IL-6 была также наиболее высока в группе больных СКВ II и III степеней активности. В то же время, продукция остальных изученных цитокинов не различалась в зависимости от степени активности заболевания. В группе больных с меньшей степенью активности иммуновоспалительного процесса продукция IL-6, оставаясь повышенной, была несколько ближе к нормальным значениям. Следует отметить, что способность к стимулированной продукции данного цитокина в выделенных группах больных практически не различалась. Вследствие этого индекс стимуляции оказался наиболее высоким (и ближе к норме) у больных 1-й группы и составил 13,6 ± 2,9, тогда как эти показатели во 2 и 3-й группах были соответственно 1,0 ± 0,03 и 3,3 ± 1,4 (p1-2 < 0,05, p1-3 < 0,05). Представленные результаты позволяют заключить, что способность к продукции IL-6, в целом повышенная при СКВ, наименее изменена в группе пациентов с I степенью активности заболевания, что подтверждается иданными ряда других исследователей, показавших положительную корреляцию уровня мРНК IL-6 с активностью СКВ [10]. Как известно, при многих классических воспалительных и аутоиммунных заболеваниях отмечена тесная связь между синтезом IL-6, содержанием CRP и клиническими признаками воспалительной активности [2]. Таким образом, нами показано, что РА и СКВ на этапе развернутых клинических проявлений характеризуются, вопервых, дисбалансом цитокинов с провоспалительными и противовоспалительными функциями (одновременное возрастание синтеза TNF, IL-6 и IL-10), способствующим поддержанию каскада иммуновоспалительных реакций, что, в свою очередь, ведет к дальнейшему аутоиммунному поражению соединительной ткани; и, вовторых, доминированием Т-хелперов 2-го типа, продукты которых — IL-6 и IL-10 — способствуют стимуляции аутоантителообразования, что также ведет к повреждению собственных тканей. Перечисленные особенности продукции цитокинов способствуют поддержанию аутоиммунного процесса на этапе клинической манифестации системных аутоимунных заболеваний.
2. Насонов Е. Современные направления иммунологических исследований при хронических воспалительных заболеваниях человека // Тер. Арх. — 2001. — № 8. — С. 43–46.
3. Станислав М., Балабанова Р., Никонова М. и др. Состояние классического и альтернативного путей активации Тлимфоцитов у больных СКВ // Тер. Арх.— 1999. — № 5. — С. 30–34.
4. Фрейдлин И.С., Кузнецова С.А. Иммунные комплексы и цитокины // Мед. Иммунол. — 1999. — Т. 1, № 1/2. — С. 27–36.
5. Andersen L., Petersen J., Bendtzen K. Production of IL-1beta, IL-1 receptor antagonist and IL-10 by blood mononuclear cells in chronic arthritis // Cytokine. — 2000. — Vol. 12, № 1. — P. 62–68.
6. Cross J., Benton H. The roles of IL-6 and IL-10 in B cell hyperactivity in systemic lupus erythematosus // Inflamm. Res. — 1999. — Vol. 48, № 5. — P. 255–261.
7. GonzalezAmaro R., PortalesPerez D., Baranda L. et al. Role of IL-10 in the abnormalities of early cell activation events of lymphocytes from patients with SLE // J. Autoimmun. — 1998. — Vol. 11, № 5. — P. 395–402.
8. Jones B., Liu T., Wong R. Reduced in vitro production of IFNgamma, Il-4 and IL-12 and increased production of IL-6, -10 and TNFalpha in systemic lupus erythematosus // Autoimmunity. — 1999. — Vol. 31, № 2. — P. 117–124.
9. Mongan A., Ramhadin S., Warrington R. IL-10 response abnormalities in SLE // Scand. J. Immunol. — 1997. — Vol. 46, № 4. — P. 406–412.
10. Nishitani Y., Kubo A., Iwano M. et al. Imbalance between IL-6 and adrenomedullin mRNA levels in peripheral blood mononuclear cells of patients with lupus nephritis // Clin. Exp. Immunol. — 2001. — Vol. 124, № 2. — P. 330–336.
11. Okubo M., Brown M., Chiba K. et al. Detection of TNFalpha and Fas ligand mRNA within synovial mononuclear cells by fluorescence incell labelling PCR // Mol. Biol. Rep. — 1998. — Vol. 25, № 4. — P. 217–224.
12. Sun K., Yu C., Tang S., Sun G. Monoclonal antidoublestranded DNA autoanti body stimulates the expression and release of IL-1 beta, IL-6, IL-8, IL-10 and TNFalpha from normal human mononuclear cells involving in the lupus pathogenesis // Immunology. — 2000. — Vol. 99, № 3. — P. 352–360.
13. VasquezDel Mercado M., DelgadoRizo V., MunozValle J. et al. Expression of IL-1 beta, TNFalpha, IL-6, -10 and -4 by freshly isolated mononuclear cells from early nevertreated and nonacute treated rheumatoid arthritis patients // Clin. Exp. Rheumatol. — 1999. — Vol.
17, № 5. — P. 575–583. 14. Wakisaka S., Suzuki N., Takeba Y. et al. Modulation by proinflammatory cytokines of Fas/FasL mediated apoptotic cell death of synovial cells in patients with RA // Clin. Exp. Immunol. — 1999. — Vol. 114, № 1. — P. 119–128.
Pro?and anti?inflammatory cytokines synthesis (IL?1?, TNF?, IL?6, IFN? and IL?10) in peripheral blood lymphoid cells of patients with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus T.V. Glazanova , L.N. Bubnova , V.I. Mazurov
Russian Institute of Hematology and Transfusiology, St. Petersburg,
St. Petersburg Medical Academy of Postgraduate Education
To estimate the role of proand antiinflammatory cytokines in maintenance of systemic autoimmune process IL?1?, TNF?, IL?6, IFN? and IL?10 synthesis by peripheral blood lymphoid cells was evaluated in 48 patients with rheumatoid arthritis (RA) and 32 patients with systemic lupus erythematosus (SLE). All the patients had clinical manifestation of the disease, its activity varied from I to III degree. In both groups significant increase of IL?6 and TNF? spontaneous production as well as IL?10 serum level was revealed. At the same time, spontaneous production of IL?1? was only slightly increased, while IFN?? production did not differ from normal level. In SLE patients, IL?6 spontaneous production increased in parallel with degree of inflammatory process activity. It was significantly higher in patients with II and III activity degree than in these with I activity degree and correlated with inflammation activity mark? ers such as level of C?reactive protein. Conclusion: in patients with developed clinical manifestation of both RA and SLE disturbance of proand antiinflammatory cytokines’ equilibrium is revealed. Thus, cascade of immune inflammatory reactions is supported and Th2?cells, producing IL?6 and IL?10 which contribute to stimulation of autoantibodies’ synthesis, begin to dominate. So, the observed pattern of cytokine production plays an essential role in maintenance of autoimmune process in patients with clinical manifestation of systemic autoimmune diseases. Key words: cytokines, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus.