Е.С. Вязьмина, В.В. Новиков, Н.А. Добротина, Н.В. Фриго, В.Д. Комарова, С.И. Новикова,Т.Г. Мартынова, Л.М.Абалкина Нижегородский государственный университет, Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии. Сывороточный уровень цитокинови растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы при сифилисе
Е.С. Вязьмина, В.В. Новиков, Н.А. Добротина, Н.В. Фриго, В.Д. Комарова, С.И. Новикова,Т.Г. Мартынова, Л.М.Абалкина Нижегородский государственный университет, Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии. Сывороточный уровень цитокинови растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы при сифилисе
Определяли уровень интерлейкина 4, интерферонагамма, а также растворимых антигенов HLA I класса1, CD95, CD502 в сыворотке крови больных манифестными формами, вторичным, ранним скрытым сифилисом (РСС) и при серорезистентности (СР) после лечения сифилиса. Концентрацию цитокинов и растворимых форм мембранных антигенов определяли иммуноферментным методом. Показано, что в сыворотке крови больных сифилисом увеличивается содержание интерферонагамма. Это предполагает наличие доминирующей активации Тхелперов 1го типа. Обнаружено, что по мере развития инфекции (манифестный вторичный сифилис, РСС, СР после лечения сифилиса) происходит снижение концентрации растворимых антигенов HLA I класса с увеличением количества больных с низким его содержанием. Среди больных различными формами сифилиса достоверное повышение уровня растворимого CD95 антигена наблюдается только у больных манифестными формами. При манифестных формах, вторичном и РСС уровень sCD50 достоверно повышен, при СР после лечения сифилиса содержание данного белка в крови достоверно понижено. Полученные результаты позволяют говорить об иммунорегуляторной роли растворимых антигенов HLA I класса, растворимых форм CD95 и CD50 антигенов, а также о преимущественой активации при сифилисе Т хелперов 1 го типа.
Ключевые слова: сифилис, цитокины, растворимая форма ICAM 3, растворимый CD95 антиген,растворимые антигены HLA I класса. Известно, что инфицирование организма бледной трепонемой сопровождается множественными нарушениями функционального состояния иммунной системы. Иммунный ответ при сифилисе может характеризоваться как активацией, так и супрессией различных звеньев клеточного иммунитета. Причины длительной персистенции возбудителя в организме, стадийности и разнообразия клинических проявлений заболевания, возникновения серорезистентности после лечения, а также отсутствия протективного иммунитета при сифилисе в настоящее время до конца не выяснены. При таких условиях являются актуальными поиск, разработка и применение новых методов оценки иммунных реакций на инфицирование организма бледной трепонемой. Поскольку функциональное состояние Т лимфоцитов может быть и причиной, и следствием разнообразных форм иммунных нарушений, наблюдающихся при сифилитической инфекции, является важным изучение особенностей реакции клеточного звена иммунной системы в ответ на персистенцию в организме Treponema pallidum.Целью настоящей работы стало установление уровня цитокинов, определяющих тип иммунного ответа — интерферона ? (IFN?), интерлейкина 4 (IL-4), а также растворимых форм мембранных антигенов HLA I класса, CD95 и СD50 антигенов в сыворотке крови больных различными формами сифилиса.
Материалы и методы
Для определения уровня растворимых антигенов HLAI класса, ассоциированных с ?2 микроглобулином 3, растворимых форм CD50, CD95 антигенов и цитокинов были использованы образцы сыворотки крови от больных различными формами сифилиса. Исследовали 73 образца сыворотки крови больных манифестными формами сифилиса, полученных из Нижегородского кожновенерологического диспансера, 40 образцов сыворотки крови больных вторичным рецидивным сифилисом, 46 образцов сыворотки больных ранним скрытым сифилисом (РСС) и 50 образцов сыворотки крови от больных с серорезистентностью (СР) после лечения сифилиса. Клинические диагнозы были поставлены и верифицированы врачебным коллективом Нижегородского КВД и НИКВИ. Образцы сыворотки крови доноров (n=310) были получены от Нижегородской областной станции переливания крови. Все образцы сыворотки крови здоровых доноров не содержали антител к вирусам гепатита В и С, HBsAg, антител класса IgMк цитомегаловирусу и антител класса IgG и IgM к возбудителю сифилиса. Использованные в работе моноклональные антитела были получены в Российском онкологическом научном центре РАМНА.Ю. Барышниковым [1]. Количественное определение IFN?и IL-4 в сыворотке крови больных различными формами сифилиса проводили с помощью наборов ООО «Протеиновый контур» (С.Петербург).Определение уровня растворимых антигенов HLA I класса(sHLAI) проводили с помощью разработанного нами иммуноферментного метода с использованием моноклональных антител (МКА) ИКО53 (против ? цепи молекул HLA I класса) иМКА ИКО216 (против ?2 микроглобулина). Для определения уровня растворимых форм CD50 и CD95 антигенов (sCD50,sCD95) применяли разработанные авторами иммуноферментные методы. С этой целью использовали поликлональные антитела против мембранных антигенов мононуклеарных клеток 3 ?22 микроглобулин — составная часть HLA молекул I класса и некоторых других белков клеточной мембраны.
Изменение изучаемых показателей иммунного ответа у больных различными формами сифилиса
крови человека, МКА ИКО 60, меченные пероксидазой хрена и направленные против антигена СD50 (определение уровня sCD50), а также меченные пероксидазой МКА ИКО160, направленные против антигена CD95 (определение уровня sCD95).При проведении статистического анализа применяли критерии МаннаУитни и Стъюдента. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия ранговой корреляции Спирмена.
Результаты и обсуждение
В реализации гуморальных и клеточных механизмов иммунного ответа важную роль играют цитокины. В связи с этим в исследовании клеточно опосредованного иммунного ответа при сифилисе представляет интерес изучение уровня цитокинов, определяющих тип иммунного ответа. Ранее было установлено, что развитие Т клеточного ответа на рекомбинантные белки Тр15, Тр17,Тр30, Тр33, Тр35, Тр47, Тр37 возбудителя сифилиса в течение экспериментальной сифилитической инфекции приводит к активации Th1 клеток[8]. В то же время, при РСС и СР после лечения сифилиса информации о количественном содержании цитокинов, определяющих тип иммунного ответа, нами не встречено. Поэтому в настоящей работе было проведено количественное исследование уровня IL-4 и IFN? у больных различными формами сифилиса. Показано, что концентрация IL-4 в сыворотке крови больных вторичным, РССи при СР после лечения сифилиса достоверно не отличалась от нормы. В то же время, уровень IFN? был достоверно повышен во всех исследованных группах больных сифилисом (рис. 1, таблица).Повышение уровня IFN? показывает, что развитие Т клеточного ответа в ходе сифилитической инфекции происходит путем смещения равновесия популяций Th1 и Th2 в сторону T хелперов первого типа. Наибольший уровень IFN? у больных вторичным сифилисом по сравнению с группами больных РСС и при СР после лечения сифилиса можно объяснить наличием персистирующей инфекции у этой группы больных, так как данный период характеризуется активным размножением возбудителя. Одним из наиболее сложных вопросов в практической сифилидологии остается вопрос о СР после лечения сифилиса, когда после полноценного специфического лечения не происходит негативации серологических реакций [3, 5, 6, 7].Повышенное содержание IFN? при СР может свидетельствовать о присутствии персистирующей в организме бледной трепонемы и наличии вследствие этого антигенной стимуляции, вызывающей выработку специфических антител класса IgG. При СР после лечения сифилиса уровень IFN? соответствует его содержанию у больных РСС, что также может свидетельствовать в пользу наличия персистенции T. pallidum в организме и косвенно — об изменении антиген презентирующей функции макрофагов. Таким образом, проведенные исследованияуровня цитокинов у больных сифилисом продемонстрировали, что развитие клеточного иммунного ответа при сифилисе происходит путем доминирующей активации Th1 клеток, что доказывает повышенная концентрация IFN? во всех исследованных группах больных. Показано, что IFN? влияет на экспрессию антигенов главного комплекса гисто совместимости I класса. В экспериментах in vitro установлено, что IFN? способен индуцировать высвобождение растворимых молекул HLA I класса [11, 12, 13]. Уровень растворимых молекул HLA I класса в сыворотке крови может отражать состояние клеточного иммунитета и процессы активации иммунной системы. Сход этих молекул с мембран в состоянии вызывать блокаду иммунного ответа [15].Нами была проведена оценка уровня sHLAI у больных различными формами сифилиса. Для количественного определения уровня sHLAI в сыворотке крови был разработан двух сайтовый иммуноферментный метод с применением МКАИКО 53 против тяжелой ? цепи молекулы HLAI и МКА ИКО 216 против ?2 микроглобулина. Разработанный метод был использован для определения сывороточной концентрации гетеродимерау больных различными формами сифилиса.Оценка среднего уровня sHLAI у больных манифестными формами, вторичным сифилисом,РСС и при СР показала, что уровень гетеродимера в сыворотке крови достоверно снижается по сравнению с соответствующим показателем в группе здоровых доноров. У больных РСС он понижался в 1,5 раза, у больных СР — в 3,3 раза(рис. 2, см. таблицу). Кроме того, индивидуальный анализ данных показал, что по мере течения сифилитической инфекции увеличивается относительное количество больных с пониженным содержанием sHLAI в сыворотке крови. Учитывая тот факт, что HLAI экспрессируется на поверхности всех ядросодержащих клеток, повышение уровня растворимого гетеродимера в сыворотке крови может происходить вследствие схода этих молекул в местах некротических повреждений тканей. При РСС и СР, когда воспалительный потенциал болезни, выраженный в клинических проявлениях и иммунологических реакциях, снижен в сравнении сманифестными формами, уровень sHLAI также понижался. Поскольку sHLAI вызывают ингибирование функции Т клеток путем блокады Т клеточного рецептора, пониженное содержание гетеродимера в сыворотке крови больных РСС и СР свидетельствует о разбалансированности иммунных реакций и снижении Т клеточной активации.
Рис. 1. Содержание интерлейкина 4 и интерферона гамма в сыворотке крови больных различными формами сифилиса.
Рис. 2. Содержание растворимых форм мембранных антигенов в сыворотке крови: 1 — доноров; 2 — больных манифестными формами сифилиса; 3 — больных вторичным сифилисом; 4 —больных ранним скрытым сифилисом; 5 — при серорезистентности. Известно, что молекулы sHLAI, появляющиеся в сыворотке крови в процессе активации иммунной системы, могут запускать апоптоз CD95+цитотоксических Т клеток, осуществляя таким образом контроль за их экспансией [15]. В связи с этим на следующем этапе настоящей работы мы определили содержание растворимой формы молекул СD95 (sCD95) в сыворотке крови больных сифилисом. Оценка уровня растворимого CD95 антигена, ингибирующего апоптоз и способного снижать проапоптотический потенциал sHLAI, показала, что достоверное повышение уровня sCD95 обнаруживалось только в группе больных манифестными формами сифилиса. Данный факт отражает наличие у этих больных молекулярных механизмов, выраженно ингибирующих апоптотические процессы (см. рис. 2).В процессах инициации иммунного ответа, кроме молекул HLA I класса, принимает участие мультимерный белковый ансамбль, в том числе и молекулы адгезии, среди которых важную роль играет белок ICAM3 (CD50 антиген). ICAM3 —главный лиганд для LFA1 и CD209 при инициации иммунного ответа [9, 10]. В доступной нам литературе отсутствуют данные о содержании, функционально диагностическом значении растворимого CD50 антигена у больных сифилисом. При оценке сывороточного уровня sCD50 у больных различными формами сифилиса было обнаружено, что во всех исследованных группах происходит достоверное изменение уровня sCD50 антигена.Уровень sCD50 был повышен при манифестных формах, при вторичном сифилисе и при РСС. При СР после лечения сифилиса он, напротив, был статистически достоверно понижен в 2,1 раза в сравнении с нормой (см. рис. 2, см. таблицу).Ранее было продемонстрировано усиление спонтанной хемилюминесценции нейтрофилов у больных первичным и вторичным сифилисом, что трактуется как возбужденное состояние клеток, то есть их активация [4]. Показано, что при активации нейтрофилов происходит шеддинг экспрессирующегося на их поверхности CD50 антигена [14].Следствием этого явления, по нашему мнению,может явиться повышение содержания его растворимой формы в сыворотке крови больных манифестными формами и при вторичном сифилисе. В то же время, у больных СР обнаружен дефицит нейтрофилов [2], который, вероятно, вносит свой вклад в изменение уровня растворимого ICAM3. В целом изменение концентрации сывороточного sCD50 антигена может являться индикатором дисбаланса иммунных реакций, наиболее выраженного, как показано рядом авторов, у больных СР формами сифилиса [3, 5, 6, 7].При оценке корреляционных взаимоотношений между исследованными показателями оказалось,что содержание sCD95 коррелирует с уровнем sCD50 у здоровых доноров, больных манифестными формами, вторичным и ранним скрытым сифилисом. При СР корреляции между этими показателями обнаружено не было. Уровень sHLAI не коррелировал с содержанием sCD50 и sCD95 антигенов во всех исследованных группах.Суммируя результаты проведенных исследований, можно заключить, что у больных сифилисом, а также при развитии СР после лечения сифилиса наблюдается повышенный уровень IFN?,что свидетельствует о доминирующей активации Th1 звена иммунного ответа. При РСС и СР послелечения сифилиса в сыворотке крови происходит снижение уровня sHLAI, что указывает на разбалансированность иммунных реакций и снижение Т клеточной активации. Достоверное повышение уровня sCD95 антигена зарегистрировано только в группе больных манифестными формами сифилиса. Этот факт отражает наличие у больных манифестными формами молекулярных механизмов, выраженно ингибирующих апоптотические процессы. Изменяется уровень растворимого CD50 антигена: от повышенного содержания у больных манифестными формами, вторичным и РСС до пониженного содержания при СР.Изменение концентрации сывороточного CD50 антигена может являться дополнительным свидетельством дисбаланса иммунных реакций при СР формах сифилиса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. — М., 1997. — 212 с.
2. Бахметьева Т. М. Роль иммунных нарушений в развитии серорезистентности при сифилисе и эффективность спленина в комплексной терапии больных: Дисс. … канд. мед. наук. — М., 1988. — 150 с.
3. Данилов С.И., Назаров П.Г. Новая концепция формирования серорезистентности после лечения сифилиса // Инфекции, передаваемые половым путем.— 2000. — № 2. — С. 16–19.
4. Резайкина А.В., Аковбян В.А., Куршакова Т.С. и др. Реактивность нейтрофилов у больных сифилисом // Вестник дерматол. венерол. — 1997. — № 2.— С. 39–41.
5. Романенко Г.Ф., Вербенко Е.Ф., Петрова И.Л. К вопросу о серорезистентном сифилисе // Вестник дерматол. венерол. — 1983. — № 6. — С. 25–29.
6. Соколовский Е.В. Серологическая резистентность после лечения сифилиса(причины и факторы развития, профилактика и лечение): Дис. … дра мед.наук. — С.Петербург, 1995. — 300 с.
7. Юцковский А.Д., Тихомирова Я.А., Стефанович Е.В. и др. К проблеме серологической резистентности при сифилитической инфекции // Инфекции,передаваемые половым путем. — 2000. — № 1. — С. 23–28.
8. Arroll T.W., CenturionLara A., Lukehart S.A. et al. T cells responses to trepone ma palludum subsp. pallidum antigens during the course of experimental syph IL-is infection // Infec. Immunity. — 1999. — Vol. 67, № 9. — P. 4757–4763.
9. Bleijs D.A., Geijtenbeek B.H., Figdor C.G. DC Sign and LFA1: a battle for ligand// Trends in immunology. — 2001. — Vol. 22, № 8. — P. 457–463.
10. Fougerolles A.R., Springer T.A. Intercellular adhesion molecular 3, a third adhesion counter"receptor for lymphocyte functionassociated molecule 1 onresting lymphocytes // J. Exp. Med. — 1992. — Vol. 175. — P. 185–190.
11. Gastl G., Ebert T., Finstad C.L. et al. Major histocompatibIL-ity complex class Iand II expression in renal cell carcinoma and modulation by interferon gamma // J. Urol. — 1996. — Vol. 155 (1). — P. 361–367.
12. He X., Le J. Alternative splicing of HLA class I transcripts induced by IFNgamma and TNF in fibroblasts: release of soluble HLA class I heavy chain and anassociate protein // Cell. Immunol. — 1995. — Vol. 162 (1). — Р. 159–168.
13. Le J., Hua J.C. Production of soluble HLA class I molecules by IFNgammainduced colonadenocarcinoma cells // Int. J. Cancer. — 1995. — Vol. 60 (4).— P. 576–571.
14. Pozo M.A., Pulido R., Munoz C. et al. Regulation of ICAM3 (CD50) membraneexpression on human neutrophIL-s through shedding mechanism // Eur. J. Immunol. — 1994. — Vol. 24 (11). — P. 2586–2594.
15. Puppo F., Contini P., Ghio M. et al. Soluble human MHC class I molecules inducesoluble Fas ligand secretion and trigger apoptosis in activated CD8+ Fas (CD95)+T lymphocytes // Int. Immunol. — 1999. — Vol. 12, № 2. — P. 195–203. Serum levels of cytokines and soluble forms of immunocompetent cell membraneantigens in syphIL-is
E.S. Vyasmina, V.V. Novikov, N.A. Dobrotina, N.V. Frigo, V.D. Komarova, S.I. Novikova, T.G.Martinova, L.M. AbalkinaNizhny Novgorod’s University, Nizhny Novgorod’s Institute of Epidemiology and Microbiology
Determination of IL-4, IFN?, soluble HLA class I antigens, soluble CD50 and CD95 levels was carriedout in sera of patients with manifestative, secondary, early latent syphIL-is and at seroresistance aftertreatment of syphIL-is. The cytokine and soluble antigens concentration have been determinated withthe aid of immunoenzyme assay. It was shown that in the sera of syphIL-itic patients the level of IFN? isincreased. It suggests that Th1 response is activated predominately. The development of infectiousprocess from manifestative syphIL-is towards seroresistance after treatment of syphIL-is results in decreasing soluble HLA class I antigens level. Patients with the manifestative forms of syphIL-is had elevated levels of soluble CD95 antigen. Manifestative, secondary and early latent syphIL-is was characterised by the raising of soluble CD50 antigen serum contents. At the seroresistance after treatment ofsyphIL-is the level of this antigen was decreased. The obtained data suggest that soluble HLA class Iantigens, CD50, and CD95 antigens have immunoregulatory role and that Th1 response is preferentialyactivated during syphIL-itic infection.Key words: syphIL-is, cytokines, soluble ICAM3, soluble CD95, soluble HLA class I antigens.