загрузка...
 
И.В. Киселева, С.Ф. Протасова, С.М. Щеканова, В.В. Жунко, А.Ю. Егоров НИИ экспериментальной медицины РАМН, СанктПетербург; 2 НИИ гриппа РАМН, СанктПетербург Цитокины в терапии рака
Повернутись до змісту

И.В. Киселева, С.Ф. Протасова, С.М. Щеканова, В.В. Жунко, А.Ю. Егоров НИИ экспериментальной медицины РАМН, СанктПетербург; 2 НИИ гриппа РАМН, СанктПетербург Цитокины в терапии рака

Новый высокоэффективный противоопухолевый препарат местнорезорбтивного действия был получен на основе комбинации некоторых рекомбинантных цитокинов человека. В наблюдениях in vivo была показана противоопухолевая эффективность рекомбинантного интерлейкина 2 (IL-2)человека, использованного не только в инъекционной форме, но и в виде мази. В опытах на мышах, которым была привита карцинома Эрлиха или лимфома L-1210, было установлено, что цитокиновые мази,  содержащие  IL-2 или  IL-2 в комбинации  c интерфероном ?2 и/или фактором некроза опухолей альфа в низких концентрациях, оказывали выраженный противоопухолевый эффект. Полученные результаты расширяют наши знания о свойствах цитокинов, используемых в терапии рака, и позволяют предположить, что простые в приготовлении и дешевые цитокиновые мази являются перспективными противоопухолевыми препаратами.

Ключевые слова: противоопухолевая терапия, цитокиновые мази, интерлейкин 2,интерферон альфа 2, фактор некроза опухолей альфа, карцинома Эрлиха, лимфома L-1210

В настоящее время в нашей стране и за рубежом широко проводится исследование и лечение больных с различными нозологическими формами заболеваний, включая онкологические, препаратами рекомбинантных цитокинов. Известно, что цитокины, такие как: интерлейкин 2 (IL-2), интерферон ?2  (IFN?2) и фактор некроза опухоли ?(TNF?) — обладают способностью останавливать опухолевый рост за счет подавления деления опухолевых клеток, ускоренного созревания дендритных клеток (клеток Лангерганса), инициирующих специфический ответ Т лимфоцитов, и стимуляции активности цитотоксических лимфоцитов и макрофагов  [3, 9, 11]. Действие этих медиаторов иммунного ответа, применяемых в виде чистых препаратов, полученных  генноинженерным путем, проявляется при их введении в кровоток животных и людей путем инъекций. В частности, показано, что препарат рекомбинантного  IL-2, используемый для лечения опухолей путем его внутривенного введения, проявляет свою эффективность за счет системной активации клеток киллеров, поражающих опухолевые клетки [3, 12].Основным недостатком инъекционной формы IL-2 является необходимость использования высоких доз препарата (более 103 МЕ/кг массы тела), при которых у больных проявляется комплекс тяжелых токсических эффектов вплоть до комы и летальных исходов [10, 13, 14]. Другим недостатком препарата является его нестабильность при введении в кровяное русло, где период его инактивации измеряется минутами [3].Есть сообщения о том, что применение концентрированных цитокиновых коктейлей приводит к осложнениям, связанным с некрозом тканей при подкожном и внутрикожном введениях, а в отдельных случаях способствует гибели больного.В литературе описана противоопухолевая композиция, включающая  IL-2,  IFN?2 и двунитевую РНК  (днРНК)  [10]. Добавление в композицию дн РНК в качестве компонента, уменьшающего токсичность цитокинов, позволило снизить необходимые дозы цитокинов, одновременно расширив область их терапевтического применения. Но при такой дн РНК цитокиновой терапии для получения положительного эффекта вливания препарата проводили не чаще двух раз в неделю с использованием дозы интерлейкина порядка 103–104 МЕ/кг массы тела, т.е. дозы, которая, согласно данным [3, 11], уже способна оказывать токсическое действие.

 

Рис. 1. Сравнительная эффективность мазевого и инъекционного способа лечения лимфомы L-1210 у мышей интерлейкином 2.

 

Рис. 2. Эффективность лечения лимфомы L

-1210 у мышей интерлейкиновой мазью, начатое на поздних сроках послеимплантации опухоли.

То, что кожа и кожные реакции связаны с внутренними процессами организма, известно давно, но работы последних лет показали, что кожа имеет полный набор клеточных элементов и их продуктов, с помощью которых она функционирует как иммунный орган  [2]. Кожа является первичной мишенью во время различных иммунных реакций и участвует как в  генерации локальных иммунных ответов, так и распространяющихся на всю иммуную систему [2].

В связи с этим задачей нашей работы явилась разработка нового метода лечения различных онкологических заболеваний путем локальных накожных аппликаций средства, содержащего в качестве активного начала рекомбинантный  IL-2 в сочетании с рекомбинантными  IFN?2 и TNF? и приготовленного в виде мази.

Материалы и методы

Цитокины. В работе использовали рекомбинантный  IL-2 человека (BIOTECH, Санкт Петербург), рекомбинантные TNF? и IFN?2 (производства НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск). Животные. Опыты ставили на белых беспородных мышах и мышах линии DBA2, половозрелых  самцах  с массой  тела 14–16  г разведения питомника  «Рапполово»  (Всеволожский район, Ленинградская область) и  содержали на  стандартном рационе. Моделирование опухолевого роста in vivo. В работе применяли две перевиваемые опухолевые линии —  карциному Эрлиха (НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова, СанктПетербург) и лимфому  L-1210  (Институт цитологии РАН, Санкт Петербург), которые поддерживали путем перевивания через организм мышей. Для поддержания карциномы Эрлиха использовали белых беспородных мышей, для лимфомы  L-1210 —мышей линии DBA 2.В опытах по моделированию опухолевого роста суспензии опухолевых клеток вводили мышам внутримышечно в правое бедро, что стимулировало локальный рост опухолей и давало возможность оценивать величину опухоли, измеряя ее диаметр (в см). Суспензии опухолевых клеток готовили на среде RPMI1640  («Биолот», Санкт Петербург) и вводили в следующих количествах: клетки карциномы Эрлиха — от5 ? 104 до 5 ? 105 клеток/мышь. Пальпируемые опухоли появлялись на 6–8 сут. и к 10–14 сут. достигали 3,5–4,0 см в диаметре, что к 25–30 дню опыта приводило к гибели подопытных  животных.  Кроме  измерения  величины  опухолей, рассчитывали процент животных с опухолями. В каждой группе было использовано не менее 10 животных. Приготовление цитокиновых мазей. В качестве фармацевтически приемлемого носителя применяли  стандартную смесь, которую готовили по общепринятой для приготовления мазей технологии на ланолинововазелиновой основе. Смешивая один или сочетания двух или трех цитокинов с носителем, получали мази с различным спектром активностей каждого из участвующих компонентов. В работе использовали следующие концентрации цитокинов (МЕ/г): IFN?2 — от 2 ? 103 до 2 ? 104; IL-2 — от 5,5 ? 103 до 2 ? 104; TNF? — 7,5 ? 103 [1]. Цитокинотерапия. 100 мг мази наносили одно-трех кратно на зону опухолевого роста, начиная с 4-го дня после имплантации опухоли, втирая в кожу больных животных. Привитых опухолью мышей контрольной  (не леченой)  группы обрабатывали одной мазевой основой  (носителем) без цитокиновых компонентов, втирая ее в соответствующие сроки в зону опухолевого роста. Наблюдение проводили в течение 10–33 дней от момента имплантации опухоли. Животных, выживших к концу  срока наблюдения, выводили из эксперимента в соответствии с «Правилами проведения работ  с использованием  экспериментальных животных» посредством эфирного наркоза.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований были поставлены эксперименты по лечению у мышей лимфомы L-1210. Известно, что эта опухолевая модель является чувствительной к IL-2 терапии [11]. В качестве терапевтического агента использовали содержащую  IL-2 в дозе 103 МЕ/г мазь, которую применяли однократно на 4 й день после введения опухолевых клеток. Для сравнения эффективности мазевой терапии с традиционными методами лечения интерлейкином 2 части мышей вводили IL-2 подкожно в дозе 103 МЕ/мышь три дня подряд на 4, 5 и 6 е сут. после имплантации опухоли. Как видно из рис. 1, к 10 у дню более чем  у  95 %  мышей  в контрольной  группе и группе,  получавшей инъекционную форму IL-2, наблюдался выраженный опухолевый рост. Эффективность инъекций  IL-2  была заметна только на 6 и7 е сут. В то же время, после мазевой терапии к 10 у дню наблюдения

Противоопухолевое действие различных по составу цитокиновых мазей на карциному Эрлиха

 

 

Рис. 3. Гибель мышей от карциномы Эрлиха в контрольной группеи группе, получавшей трехкомпонентную мазь.

число животных опухоленосителей не превышало 25 % (рис.1).Таким образом, эффект от терапии средством накожного применения, содержащим  IL-2, был значительно более выражен по сравнению с известным способом терапии с помощью инъекций.В случае начала лечения лимфомы L1210 в более поздние сроки  (на 9 й день после имплантации опухолевых клеток) после трехкратного (на 9,10 и 11 й дни) нанесения мази, содержащей IL-2 в концентрации 104 МЕ/г, также достигался выраженный терапевтический эффект (рис.2).Положительный противоопухолевый эффект был достигнут не только при введении чувствительной к IL-2 лимфомы L1210, но и в отношении опухоли, известной своей резистентностью к IL-2 терапии  (карцинома Эрлиха)  [11]. Лечение мышей опухоленосителей проводили однократно на 4 й день после имплантации опухоли. Использовали мази, содержащие 2 ? 104 МЕ/г  IL-2 или IFN?2, а также мазь, содержащую оба компонента с той же активностью. Цитокиновые мази были эффективны при лечении карциномы Эрлиха в разной степени. Более выраженный лечебный эффект был достигнут при применении комбинированной мази, содержащей интерлейкиновый и интерфероновый компонент (таблица). По данным литературы  [12], подобный лечебный эффект в отношении карциномы Эрлиха в экспериментах на мышах достигался путем многократных инъекций  IL-2 в дозе, в 100 раз превышающей используемую нами. Высокий терапевтический эффект трехкомпонентной цитокиновой мази был отмечен при на кожном применении для лечения карциномы Эрлиха даже в случае десятикратного снижения концентрации отдельных компонентов по сравнению с монопрепаратами. Так, при сравнительном изучении противоопухолевой активности однократного использования мазей, содержащих2 ? 104 МЕ/г IFN?2, IFN?2 + TNF? (2 ? 104 МЕ/ги 7,5 ? 103 МЕ/г   соответственно) или  IFN?2 +TNF? +  IL-2  (2 ? 103 МЕ/г,  7,5 ? 103 МЕ/г и5,5 ? 103 МЕ/г соответственно), наибольшей эффективностью обладала мазь, содержащая трикомпонента. Как видно из таблицы, применение трехкомпонентного цитокинового препарата приводило к отчетливому терапевтическому эффекту. Интересно, что  гибель мышей от карциномы Эрлиха в группе, которую лечили трехкомпонентной мазью, начиналась только тогда, когда в контрольной группе животных летальность составляла уже 100 % (рис. 3).Кроме того, отмечено пролонгированное лечебное действие комбинированного препарата посравнению с монопрепаратами. Так, к 15 у дню после имплантации опухолей в контрольной группе мышей и в группах, которых лечили монопрепаратами цитокинов  (IFN?2 или  IL-2), опухоли достигали 3–4 см в диаметре и составляли 1/5–1/6 часть от веса тела животных. В  группе мышей, получавших комбинированный препарат, к 15 у дню опыта диаметр опухолей составлял около 1 см и не превышал 1,5–2,0 см ко дню учета опыта —33 м сут. после имплантации. Таким образом, была установлена высокая противоопухолевая эффективность мазевого средства, содержащего низкие (нетоксичные) концентрации цитокинов  (на 1–2 порядка ниже применяемых в лечении традиционными методами введения). Она достигалась за счет возможного синергизма действия IL-2, IFN?2 и TNF?. При этом полностью отсутствовало побочное токсическое действие препаратов, проявлялся выраженный пролонгированный эффект. Начато изучение разработанных мазевых препаратов, содержащих разрешенные для применения у людей цитокины, на ограниченном количестве добровольцев, больных раком разной локализации (рак легкого, яичников и др.) [4–7]. Показано, что, не оказывая побочного действия, а также быстро снимая токсикоз и улучшая общеесостояние больных, препараты обладали еще и анальгезирующими свойствами. В силу использования низких концентраций активного начала в мазях лечение может обходиться в 100 и более раз дешевле, чем традиционная цитокинотерапия в виде инъекций. Вероятно, локальное использование разработанных препаратов многократно усиливает их стимулирующее воздействие содержащихся в них цитокинов на клеточный противоопухолевый иммунитет непосредственно в месте расположения опухоли, но при этом из-за применения нетоксичных доз цитокинов отсутствуют специфические для такой терапии осложнения. Полученные результаты расширяют наши знании я о свойствах цитокинов, используемых в терапии рака, и позволяют предположить, что простые в приготовлении и дешевые цитокиновые мази являются перспективными противоопухолевыми препаратами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Егоров А.Ю., Щеканова С.М., Протасова С.Ф., Киселева И.В. Противоопухолевое средство местнорезорбтивного действия на основе интерлейкина человека: Патент РФ № 2117472 // Бюл. изобр. — 1998. — № 23.

2. Зимина И.В., Лопухина Ю.М., Арион В.Я. Кожа как иммунный орган: клеточные элементы и цитокины // Иммунология. — 1994. — № 1. — С. 8–12.

3. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. — СПб.: Гиппократ, 1992. — 256 с.

4. Киселева И.В., Протасова С.Ф., Жунко В.В., Щеканова С.М. Цитокины в лечении рака  // Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы». —1999. — Т. 3. — № 1. — С. 48.

5. Киселева И.В., Протасова С.Ф., Жунко В.В., Щеканова С.М.  Трансдермальные препараты цитокинов в лечении рака // В сб.: Всеросс. науч. конф. смеждународн. участием, посвящ. 150 летию со дня рожд. акад. И.П. Павлова. — СПб., 1999. — С.177.

6. Киселева И.В., Протасова С.Ф., Жунко В.В., Щеканова С.М. Препараты цитокинов местнорезорбтивного действия в лечении опухолей // В сб.: Мат.научн. конф. «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», посвящ. 110летию НИИЭМ РАМН. — СПб.,2000. — С. 75–76.

7. Протасова С.Ф., Щеканова С.М., Киселева И.В., Жунко В.В. Новые подходык лечению рака // Int. J. ImmunorehabIL-. — Т. 3. — № 1. — С. 184.

8. Пустыльник Е.И. Статические методы анализа и обработки наблюдений. —М.: Наука, 1968. — 288 с.

9. Фрейдлин И.С. Дендритные клетки и клетки Лангерганса // В кн.: Иммунная система и ее дефекты: Руководство для врачей. — СПб.: Полисан. —1998. — С. 34–36.

10. Хем Ричерс Инк, Картер B.A. Противоопухолевая композиция: Патент СССР№ 1836103 // Бюл. изобр. — 1993. — № 31.

11. Heaton K.M., Grimm E.A. Cytokine  combination  in  immunotherapy  for  solidtumors:  a  review  // Cancer  Immunol.  Immunother. — 1993. — Vol. 37. —P. 213–219.

12. Herberman R.B. Summary: potential of Interleukin2 for the therapy of cancer// J. Biol. Response Modifiers. — 1994. — Vol. 3. — P. 527–532.

13. Smith K.A. Lowerst dose  interleukin2  immunotherapy // Blood. — 1993. —Vol. 81, № 6. — Р. 1414–1423.

14. Walters R.S., Theriault R.L., Holmes F.A. et al. Phase II study of recombinantalphainterferon and recombinant interleukin2 metastatic breast cancer // J.Immunother. With Emphasis On Tumor Immunol. — 1994. — Vol. 16. — № 4.— Р. 303–305.

Cytokines in cancer therapyI.V. Kiseleva1, S.F. Protasova2, S.M. Shchekanova2, V.V.Zhunko2, A.Yu.Egorov11 Institute of Experimental Medicine RAMS, St.Petersburg; 2 Institute of Influenza RAMS, St.Petersburg

A new highly effective antitumor transdermal preparation containing combination of recombinant human cytokines was obtained. Recombinant human interleukin 2 (IL-2) was shown to act in vivo both ininjection form and in transdermal ointment form from the skin and mucous membranes. Experiments inmice  infected with  two  tumor  cell  lines  (Ehrlich  carcinoma or  lymphoma L1210) demonstrated  thatthe effect of  local  therapy with ointment  containing  IL-2 alone, or various  combinations of  IL-2, alphainterferon and/or tumor necrosis factoralpha, was marked. These studies extend our knowledgeof the properties of cytokines used for cancer treatment and suggest that cytokine ointment may havefuture potential for development as a specific antitumor drug.Key words: antitumor therapy, cytokine ointments, interleukin 2, alpha2interferon, tumor necrosis factoralpha, Ehrlich carcinoma, lymphoma L1210.



загрузка...