С.В. Минаев Ставропольская государственная медицинская академия Значение цитокинов в патогенезе острой хирургической патологии брюшной полости
Проведенное исследование цитокинового статуса у 34 больных с острым флегмонозным аппендицитом показало повышение уровня провоспалительных цитокинов: IL-2 — до 466,5 ± 46,9 пкг/мл (p < 0,01), TNF? — до 101,1 ± 17,5 пкг/мл (p < 0,05), IL-6 — до 102,9 ± 12,1 пкг/мл, а также повышение концентрации противовоспалительного цитокина IL-4 до 27,3 ± 4,1 пкг/мл (p < 0,05). Использование в послеоперационном периоде полиферментного препарата Вобэнзим позволило нормализовать показатели цитокинового статуса у больных с острой хирургической патологией брюшной полости за счет снижения уровня провоспалительных (IL-2, IL-6, TNF?) и повышения уровня противовоспалительных (IL-4) цитокинов. Благодаря этому предотвращалось развитие осложнений после проведения аппендэктомии. (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 2. С. 41–46.)
К настоящему времени установлено, что любая травма, хирургическое вмешательство или анестезиологическое пособие сопровождается угнетением иммунитета [5, 19]. Определение степени иммунодефицита, а также факторов и механизмов, приводящих к развитию местных и системных осложнений, является чрезвычайно важным для правильного ведения больных в послеоперационном периоде. Воспалительные и иммунные реакции являются результатом взаимодействия большого количества различных систем организма. Иммунные клетки секретируют многочисленные растворимые медиаторы, часть которых является высокоспецифическими [1, 8]. Вне воспалительной реакции и иммунного ответа цитокины в крови содержатся в чрезвычайно малом количестве. Усиленный синтез цитокинов начинается в ответ на проникновение в организм микроорганизмов или повреждение тканей. Одним из наиболее сильных индукторов синтеза цитокинов служат компоненты клеточных стенок бактерий: ЛПС, пептидогликаны и мурамилдипептиды [10]. В зависимости от характера воздействия на воспалительный процесс цитокины подразделяют на две большие группы [12, 17]: провоспалительные (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF?, IFN?) и противовоспалительные (IL-4, IL-10, TGF?). Помимо этого имеются регуляторные системы, которые инактивируют уже высвобожденные цитокины. К ним относится антипротеазная система [7], которая совместно с сывороточными гидролазами осуществляет контроль над распределением, активностью и разрушением серии цитокинов (TNF?, IL-1?, IL-2, IL-6, IFN, CSF). Результаты исследований свидетельствуют о значимом влиянии полиферментных препаратов, используемых для проведения системной энзимотерапии (СЭТ), на Т и Вклеточное звено иммунитета, которое осуществляется через цитокиновую сеть, факторы роста, молекулы адгезии и ряд других факторов [7, 16]. Воздействие на ключевые механизмы патогенеза иммуновоспалительного процесса обосновывает применение полифермент ных препаратов у больных с различными заболеваниями [3]. Однако у больных с острыми хирургическими заболеваниями органов брюшной полости препараты СЭТ практически не применялись.
Целью работы было определение цитокинового статуса у детей с острой хирургической патологией органов брюшной полости и проведение его коррекции для снижения послеоперационных осложнений.
Материалы и методы
Исследование проводили на базе хирургического отделения Детской краевой клинической больницы г. Ставрополя. Изучение цитокинового статуса проводили у 34 больных в возрасте 10–14 лет с острым флегмонозным аппендицитом. Все больные были разделены на 2 группы: основная группа (18 пациентов) и контрольная группа (16 пациентов). После проведения аппендэктомии все пациенты получали стандартную антибактериальную (гентамицин в дозе 4 мг/кг/сут с метронидазолом—250 мг 2 раза в сут) и противоболевую терапию (трамал в дозе 2 мг/кг, метамизол натрия—300 мг 2–3 раза в сут). В основной группе, начиная с конца первых суток и на протяжении последующих 4 нед., применяли полиферментную терапию. В качестве препарата использовали Вобэнзим. Полиферментный препарат Вобэнзим (Мукос Фарма, Германия) имеет в своем составе: панкреатин — 345 прот. Евр. Фарм.,Едпапаин — 90 F.I.P,Ед., бромелаин — 225 F.I.P,Ед., трипсин — 360 F.I.P,Ед., химотрипсин — 300 F.I.P,Ед., амилаза — 50 F.I.P,Ед., липаза — 34 F.I.P,Ед., рутозид — 50 мг (рег. уд. П № 011530/01,1999 от 30.11.1999). Вобэнзим применяли по 1 драже на 6 кг массы тела 3 раза в сут. Для определения нормального уровня цитокинов определяли их содержание у 15 практически здоровых добровольцев в возрасте 14–19 лет (группа сравнения). Во всех группах у каждого пациента осуществляли забор 5 мл венозной крови из локтевой вены на момент поступления в стационар. Кроме этого в основной и контрольной группах производили взятие крови через 3 и 7 дней после операции. Количественное определение концентрации фактора некроза опухолей альфа (TNF?), интерлейкинов 2, 4 и 6 (IL-2, IL-4, IL-6) проводили с помощью иммуноферментного метода, для которого использовали наборы реагентов ООО «Протеиновый контур» (Санкт Петербург). Математическую обработку полученных результатов проводили с использованием методов вариационной статистики. Для определения тенденции и прогнозирования динамики уровня цитокинов у больных с острым аппендицитом был про, веден множественный регрессионный анализ [2]. При проведении анализа определяли связь между несколькими независимыми переменными (регрессорами или предикторами) и зависимой переменной, в качестве которых выступали уровни цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, TNF?) до операции, на третьи и седьмые сутки после операции. На основе множественной регрессии осуществляли построение линии тренда, которая позволила графически отобразить тенденцию данных. Все расчеты и графическое представление полученных результатов производили с использованием программ Microsoft Excel 2002, Biostatistics 4.03.
Результаты и обсуждение
В основной группе послеоперационный период (7 ± 0,2 койконей) был достоверно короче, чем в контрольной группе (8,6 ± 0,4 койкодней) (р < 0,05). Это было связано с более быстрым купированием воспаления—как общего, так и местного—в группе детей, где использовался полиферментный препарат. При этом в основной группе также раньше нормализовалась температура и купировался болевой синдром—2 ± 0,2 против 3,4 ± 0,4 сут (р < 0,05) в контрольной группе. Заживление послеоперационной раны в основной группе происходило быстрее—к 6,8 ± 0,1 сут (р < 0,05) после аппендэктомии, в то время как в контрольной группе—к 7,9 ± 0,2. Течение раневого процесса сопровождалось отеком в области послеоперационной раны, который купировался в 1,5 раза быстрее (р < 0,05) в основной группе, чем в контрольной. Благодаря применению полиферментной терапии в послеоперационном периоде отсутствовала гиперемия, в то время как в контрольной группе она имела место на протяжении 1,6 ± 0,1 сут. Использование в комплексном послеоперационном лечении полиферментной терапии позволило уменьшить длительность антибактериальной терапии в основной группе до 4,5± 0,3 сут, в то время как в контрольной группе она применялась 6,8 ± 0,3 сут (р < 0,05). В основной группе осложнений не отмечалось. В контрольной группе отмечалось развитие поздней спаечной кишечной непроходимости у одного ребенка. Для изучения иммунологических показателей и возможностей коррекции их нарушений при острой хирургической патологии брюшной полости нами были исследованы уровни медиаторов воспаления (цитокинов). Острый аппендицит является самым частым заболеванием органов брюшной полости у детей и нередко сопровождается гнойновоспалительными осложнениями и спаечным процессом в брюшной полости. У детей с острым аппендицитом по сравнению со здоровыми добровольцами выявлено повышение уровня провоспалительных цитокинов: IL-2— до 466,5± 46,9 пкг/мл (p < 0,01), TNF? — до 101,1 ± 17,5 пкг/мл (p < 0,05), IL-6 — до 102,9 ± 12,1 пкг/мл. Что касается противовоспалительных цитокинов, то отмечалось достоверное повышение уровня IL-4 до 27,3 ± 4,1 пкг/мл (p < 0,05) (рис. 1).
Рис.1. Показатели цитокинового статуса у детей с острым флегмонозным аппендицитом * — достоверность различий показателей между группами (p < 0,05); ** — достоверность различий показателей между группами (p < 0,01)
Следующим этапом исследования было определение динамики изменения уровня цитокинов и характера воспаления у больных с острым аппендицитом. Для этого нами был проведен множественный регрессионный анализ. На основе множественной регрессии строили графики, отображавшие тенденцию изменений уровня цитокинов в основной и контрольной группах. Регрессионный анализ провоспалительных цитокинов выявил тенденцию к снижению уровня IL-2, начиная с третьих послеоперационных суток в обеих группах, о чем свидетельствовал отрицательный характер линий тренда. У больных, которые получали в послеоперационном периоде Вобэнзим, отмечалась четко выраженная тенденция к резкому снижению уровня этого провоспалительного медиатора в период с третьих суток по седьмые. Распределение IL-2 в основной группе описывалось полиномиальной аппроксимацией, которая выражалась уравнением y = –429x2+1665x–771 (рис. 2, а). В контрольной группе был характерен аналогичный тип аппроксимации в виде кривой y = –147,5x2+707,5x+15 с отрицательным характером тренда (рис. 2, б). При этом в обеих группах коэффициент детерминации r2 равнялся 1, т. е. характер выбранной аппроксимации соответствовал всем имеющимся в исследовании данным. Тенденция концентрации противовоспалительного цитокина IL-4 в обеих группах после операции носила возрастающий характер распределения. При этом в основной группе отмечался более сильный тренд в синтезе противовоспалительного цитокина IL-4, особенно выраженный к седьмым суткам после оперативного вмешательства. Линия тренда IL-4 в основной группе, выраженная уравнением экспоненциальной аппроксимации y = 14,014e 0,5493x, представлена на рис. 3, а. В контрольной группе также отмечалась экспоненциальная аппроксимация, выраженная уравнением y = 15,117e0,3569x (рис. 3, б). Коэффициент детерминации r2 в основной группе составлял 0,99, а в контрольной—0,79. Регрессионный анализ концентрации про воспалительных цитокинов выявил тенденцию к снижению уровня IL-6 после оперативного вмешательства в обеих группах, о чем свиде тельствовал отрицательный характер линий тренда. В контрольной группе линия регрессии имела, наряду со снижением уровня этого медиатора воспаления к третьим суткам, умеренный подъем к седьмым суткам. Показатель уровня IL-6 в основной группе имел линию тренда, выраженную в виде уравнения экспоненциальной аппроксимации y = 109,49e–0,3061x. В контрольной группе отмечалась полиномиальная аппроксимация, описываемая следующим выражением: y = 40x2–186x+264. Коэффи циент детерминации в основной группе равнялся 0,97, а в контрольной —1, т. е. характер выбранных аппроксимаций соответствовал имеющимся данным. Регрессионный анализ уровня TNF? в основной группе выявил тенденцию к снижения уровня этого воспалительного цитокина в обеих группах, на что указывал отрицательный характер линии трендов TNF? после операции. Вместе с тем в контрольной группе линия тренда показала наличие подъема этого медиатора воспаления к третьим суткам. Динамика концентрации TNF? имела экспоненциальный характер аппроксимации в виде кривой y = 178,45e–0,468x. В контрольной группе характер линии тренда характеризовался полиномиальной аппроксимацией в виде кривой y = –59x2+219x–58. Коэффициент детерминации в основной группе равнялся 0,9, а в контрольной—1.
Рис. 2. Линия тренда полиномиальной аппроксимации концентрации IL-,2 у больных с острым аппендицитом в основной и контрольной группах
Рис. 3. Линия тренда экспоненциальной аппроксимации концентрации IL-,4 у больных с острым аппендицитом в основной и контрольной группах
Основываясь на полученных в исследовании линиях тренда, у хирургов появляется возможность судить о течении послеоперационного периода у больных с острой хирургической патологией органов брюшной полости. Графическое представление динамики изменения уровней медиаторов воспаления во время заболевания позволяет наглядно и, самое главное, быстро оценить отклонения в ходе воспалительного процесса в послеоперационном периоде. Динамическое исследование состояния цитокинового статуса позволяет определить у пациента не только концентрацию медиаторов воспаления в крови, но и характер течения воспалительного процесса в целом (в сторону его усиления или ослабления). Резкий подъем уровня провоспалительных цитокинов может свидетельствовать о развитии гнойновоспалительного осложнения в послеоперационном периоде (на стадии доклинических проявлений). Проводимые в связи с этим лечебные мероприятия направлены на коррекцию как местных (со стороны оперативного вмешательства), так и общих проявлений воспалительного процесса. Низкий уровень противовоспалительных цитокинов в крови и снижение линии их тренда ниже оптимального уровня являются показателем недостаточности иммунного ответа на хирургическое вмешательство, а также маркером нарушения репаративных процессов у пациента. Подобные проявления свидетельствуют о затяжном течении (хронизации) воспалительного процесса. Особую актуальность приобретает данный показатель у больных со спаечным процессом брюшной полости. Для профилактики и лечения адгезивного процесса в брюшной полости патогенети чески обоснованным является применение препаратов, направленных на коррекцию недостаточности противовоспалительных цитокинов. В проведенном нами исследовании под действием полиферментной терапии отмечалось более раннее восстановление иммунологических показателей. Применение в послеоперационном периоде Вобэнзима позволило нормализовать цитокиновый статус больных с острой хирургической патологией за счет снижения уровня провоспалительных (IL-2, IL-6, TNF?) и повышения уровня противовоспалительных (IL-4) цитокинов. Использование в лечебном процессе Вобэнзима позволило сократить длительность госпитализации больных с острым аппендицитом. Большинство препаратов для лечения послеоперационных ран применяются, в основном, местно. Принципиально новым подходом в лечении и модуляции раневого процесса представляют собой препараты СЭТ. Введенные внутрь комбинированные энзимы частично всасываются в кровь и проявляют системное действие на организм [6]. При этом полиферментные препараты воздействуют на рану дистанционно и оказывают противовоспалительное, противоотечное и иммуномодулирующее действие [4]. Механизм течения воспалительного процесса в брюшной полости сложен и многогранен. Благодаря ряду работ [5, 14, 18] наши познания в физиологии и патофизиологии воспаления существенно расширились. На настоящий момент патогенез воспалительного процесса может быть представлен следующим образом. После повреждения тканей и сосудов происходит агрегация тромбоцитов и образование фибрина. Под действием тромбоцитов происходит активация каскада факторов свертывания крови. Образуется тромб и останавливается кровотечение. При этом в месте повреждения образуется комплекс матричных белков, состоящий из коллагена и фибронектина, к которым мигрируют фибробласты и иммунокомпетентные клетки [10, 23]. Иммуноциты выделяют провоспалительные цитокины (IFN?, TNF?, IL-1, IL-2 и IL-6). Благодаря действию последних происходит активация эндотелия и иммуноцитов, находящихся в кровяном русле. В поврежденную ткань проникают нейтрофилы и макрофаги, которые в начальной стадии ответственны за фагоцитоз микроорганизмов, высвобождение цитокинов и лизосомальных ферментов [11, 15, 21]. На этой стадии происходит высвобождение таких ростовых факторов, как TGF? и PDGF. Эти факторы ответственны за образование матричных белков и миграцию фибробластов к месту повреждения, определяя тем самым формирование грануляционной ткани. В зависимости от размеров образованного комплекса матричных белков и величины миграции фибробластов к месту повреждения зависит степень выраженности фиброзных изменений в месте повреждения. Течение раневого процесса в норме сопровождается резорбцией избыточной рубцовой ткани [14, 22]. Этому способствуют, прежде всего, металлопротеиназы, продуцируемые гранулоцитами и макрофагами. Эти ферменты разрушают избыточно развившуюся рубцовую ткань и восстанавливают гомеостаз в поврежденной ткани. Соотношение между образованием и рассасыванием рубцовой ткани—чрезвычайно важный параметр, который определяется равновесием между факторами роста. На внеклеточный матрикс кроме ростовых факторов и протеиназ оказывают воздействие адгезивные молекулы [10, 17, 20]. Последние связывают иммунные и эндотелиальные клетки с белками матрикса, а также обеспечивают контакт между клетками, стимулируют синтез и освобождение факторов роста. Благодаря этому происходит дальнейшее образование матричных белков. Типичным представителем, участвующим в процессе адгезии и регуляции иммуноцитов, является адгезивная молекула CD44. К настоящему времени установлена регулирующая роль целого ряда молекул адгезии: ICAM 1, LFA 1, PECAM 1, ELAM 1, VCAM 1 и группы кадхеринов [9]. На основании имеющихся данных точки приложения препаратов СЭТ в воспалительном процессе органов брюшной полости будут следующими. Входящие в состав Вобэнзима бромелаин, трипсин, химотрипсин и папаин являются регулирующими ферментами в организации раневого матрикса, в том числе и в образовании комплекса матричных белков. Регуляция этого процесса возможна за счет подавления излишнего синтеза факторов роста, в том числе и TGF? [13, 16]. При этом количество синтезируемых внеклеточных матричных белков в месте повреждения брюшины становится достаточным только для протекания физиологического заживления. Происходит восстановление равновесия между факторами роста и эндогенными ферментами. Комплексное воздействие протеиназ препарата Вобэнзим препятствует развитию излишней фиброзной (рубцовой) ткани. Использование в послеоперационном периоде Вобэнзима позволило нормализовать показатели цитокинового статуса у больных с острой хирургической патологией брюшной полости за счет снижения уровня провоспалительных (IL-2, IL-6, TNF?) и повышения уровня противовоспалительных (IL-4) цитокинов. Благодаря этому предотвращалось развитие осложнений после аппендэктомии. Можно полагать, что клиническая эффективность полиферментных препаратов у больных в послеоперационном периоде связана не только со снижением концентрации цитокинов в крови, но и с блокированием их провоспалительного действия на уровне клеток мишеней. Возможно, что элиминация цитокиновых рецепторов является регуляторным механизмом, противодействующим реализации провоспалительных эффектов цитокинов [3]. Установленное воздействие протеолитических ферментов на цитоки новый профиль можно рассматривать как возможный фактор супрессии воспалительного компонента у больных с острыми хирургически ми заболеваниями органов брюшной полости. Таким образом, травму, наносимую операцией, необходимо рассматривать как местный воспали тельный процесс, который контролируется иммунорегуляторной системой. Высвобождение клеточных медиаторов и детрита в связи с операционной травмой вызывает общую реакцию иммунной системы. Неадекватный местный и общий иммунный ответ приводит к нарушению процесса заживления раны. Опосредованная цитокинами и адгезивными молекулами недостаточность иммунологического контроля в конечном итоге способствует развитию местных и системных осложнений после хирургического вмешательства.
ЛИТЕРАТУРА 1. Бельмер С.В., Симбирцев А.С., Головенко О.В. и др. Значение цитокинов в патогенезе воспалительных заболеваний толстой кишки у детей // РМЖ. — 2003. — Т. 11. — № 3. — С. 17–22.
2. Лукьянова Е.А. Медицинская статистика: Учеб. пособие. — М.: Издво РУДН, 2002. — 255 с.
3. Мазуров В.И., Лила А.М., Столов С.В., Кнорринг Г.Ю. Опыт применения системной энзимотерапии при некоторых заболеваниях внутренних органов // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1. — № 3. — С. 31–37.
4. Минаев С.В. Клинико-экспериментальная оценка динамики заживления ран в детской хирургии // Вест. хирургии им. И.И. Грекова. — 2003. — Т. 162, № 4. — С. 57–63.
5. Раны и раневая инфекция: Рук. для врачей / Под ред. М.И. Кузина, Б.М. Костюченок. — М.: Медицина, 1990. — 592 с.
6. Системная энзимотерапия. Современные подходы и перспективы / Под ред. В.И. Мазурова, А.М. Лила. — СПб., 1999. — 224 с.
7. Системная энзимотерапия. Теоретические основы, опыт клинического применения / Под ред. К.Н. Веремеенко, В.Н. Коваленко. — Киев: Морион, 2000. — 320 с.
8. Стрижова Я.В., Щегловитова О.Н., Расстегаева И.Н. и др. Системная энзимотерапия в гинекологии: Сборник / Под ред. М. А. Репиной. — СПб., 2002. — С. 108–109.
9. Chegini N., Rong H., Bennett B. et al. Peritoneal fluid cytokine and eicosanoid levels and their relation to the incidence of peritoneal adhesion // J. Soc. Gy, necol. Investig. — 1999. — Vol. 6, № 3. — Р. 153–157.
10. Desser L., Rehberger A., Kokron E. et al. Cytokine synthesis in human peripheral blood mononuclear cells after oral administration of polyenzyme prepara, tions // Oncology. — 1993. — Vol. 50, № 5. — Р. 403–407.
11. Diegelmann R.F., Evans M.C. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing // Front. Biosci. — 2004. — Vol. 9, № 1. — Р. 283–289.
12.Galley H.F., Webster N.R. The immuno,inflammatory cascade // Br. J. An, aesth. — 1996. — Vol. 77. — Р. 11–16.
13. Gardner M.L.G., Steffens K.,J. Absorption of orally administered enzymes. — Springer, Berlin Heidelberg New York, 1995. — 83 p.
14. Jenkins K., Javadi M., Borghaei R.C. Interleukin,4 suppresses IL-1,induced ex, pression of matrix metalloproteinase,3 in human gingival fibroblasts // J. Pe, riodontol. — 2004. — Vol. 75, № 2. — Р. 283–291.
15. Kohyama T., Liu X., Wen F.Q. et al. IL-4 and IL-13 induce chemotaxis of human foreskin fibroblasts, but not human fetal lung fibroblasts // Inflammation. — 2004. — Vol. 28, № 1. — Р. 33–37.
16. Manhart N., Akomeah R., Bergmeister H. et al. Administration of proteolytic enzymes bromelain and trypsin diminish the number of CD4+ cells and the in, terferon,? response in Peyer’s petches and spleen in endotoxemic balb/c mice // Cell. Immunology. — 2002. — Vol. 215. — P. 113–119.
17.Muzio M., Bosisio D., Polentarutti N. et al. Differential expression and reg, ulation of toll,like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expres, sion of TLR3 in dendritic cells // J. Immunol. — 2000. — Vol. 164. — Р. 5998–6004.
18. Namba K., Kitaichi N., Nishida T., Taylor A.W. Induction of regulatory T cells by the immunomodulating cytokines alpha,melanocyte,stimulating hormone and transforming growth factor,beta 2 // J. Leukoc. Biol. — 2002. — Vol. 72, № 5. — P. 946–952.
20. Stauder H. Evidence that TGF,? should be a therapeutic target in diabetic nephropathy // Kidney Internat. — 1998. — Vol. 54. — Р. 1390–1391.
21.TrevanIL- A.S., Andonegui G.A., Isturiz M.A. et al. Effect of proteolytic en, zymes on neutroph FcRII activity // Immunology. — 1994. — Vol. 82. — Р. 632–637.
22. Wald M. Wound healing under pathological conditions // Int. medicina pro praxi. — 2002. — № 10. — Р. 6–10.
23. Wong C.K., Ip W.K., Lam C.W. Biochemical assessment of intracellular signal transduction pathways in eosinophs: implications for pharmacotherapy // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. — 2004. — Vol. 41, № 1. — P. 89–103.
The role of cytokines in acute surgical abdominal pathology S.V. Minaev State Medical Academy, Stavropol
The study of cytokines in the sera of 34 phlegmonous appendicitis patients showed an increase of proinflammatory cytokine levels: IL-2 up to 466,5 ± 46,9 pg/ml (p < 0,01), TNF? ? ? ? ? up to 101,1 ± 17,5 pg/ml (p < 0,05), IL-6 — 102,9 ± 12,1 pg/ml, and increase of antiinflammatory cytokine IL-4 up to 27,3 ± 4,1 pg/ml (p < 0,05). Administration of polyenzyme medication Wobenzym after surgical treatment led to normalization of cytokine levels due to proinflammatory cytokine (IL-2, IL-6, TNF? ? ? ? ?) decrease and increase of antiinflammatory cytokine (IL-4). This allowed to prevent complications in patients who underwent an appendectomy.
(Cytokines and Inflammation. 2004. Vol. 3, № 2. P. 41–46.)
