И.В. Нестерова , А.А. Евглевский , Е.В. Фомичева , В.В. Парфенов Учебно-научный центр Медицинского центра Управления делами Президента РФ, Москва; Кафедра гистологии Кубанской медицинской академии, Краснодар; Российский Центр функциональной хирургической гастроэнтерологии, Краснодар; НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва Особенности активационного потенциала ядер нейтрофильных гранулоцитов в норме и патологии
И.В. Нестерова , А.А. Евглевский , Е.В. Фомичева , В.В. Парфенов Учебно-научный центр Медицинского центра Управления делами Президента РФ, Москва; Кафедра гистологии Кубанской медицинской академии, Краснодар; Российский Центр функциональной хирургической гастроэнтерологии, Краснодар; НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва Особенности активационного потенциала ядер нейтрофильных гранулоцитов в норме и патологии
Изучали особенности активации ядер нейтрофильных гранулоцитов (НГ) периферической крови здоровых людей в покое и после активации бактериальным антигеном, а также степень активации ядер нейтрофилов у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в процессе хирургического лечения. Активность хроматина ядер НГ тестировали методом поляризационной микроскопии после окраски клеток толуидиновым синим (рН 5,0). У здоровых лиц контрольной группы степень активации ядер НГ зависела от дозы бактериального антигена: чем выше была его концентрация, тем более выраженной была степень активации ядер. У больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, осложненной стенозом, наблюдалась активация хроматина ядер НГ; степень активации возрастала под влиянием операционного стресса и затем постепенно возвращалась к предоперационному уровню, однако не достигала контрольных параметров. (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 2. С. 52–55.)
Ядерный хроматин нейтрофильных гранулоцитов (НГ), как и других клеток, в процессе функционирования способен к сложным конформационным превращениям, изменяющим его физикохимические свойства. Биологическим следствием этих превращений является активация хроматина. Физико-химические свойства хроматина НГ могут быть тестированы методом поляризационной микроскопии, проведенной после окраски ядер клеток толуидиновым синим (рН 5,0), при которой хроматин обнаруживает эффект двулучепреломления—анизотропию [1, 2, 7, 12]. Величина анизотропии отражает структурную упорядоченность хроматина, который является основным носителем генетической информации в клетке. Снижение уровня анизотропии может интерпретироваться как показатель, свидетельствующий о явлениях деспирализации хроматина, сопровождающихся ослаблением химических связей комплекса ДНК—гистон в ядрах клеток. Подобные явления указывают на биологическую активацию хроматина, что является предпосылкой для появления матричной активности ДНК [8] и, возможно, последующего белкового синтеза. Ранее считалось, что зрелые НГ, ввиду слабого развития белоксинтезирующего аппарата, не обладают способностью к синтезу белка de novo. Однако в настоящее время доказано сохранение у нейтрофилов белоксинтезирующего потенциала, что было документировано результатами опытов с мечеными аминокислотами и основаниями РНК. По современным представлениям, синтезированные de novo белки нейтрофилов являются информационно-регуляторными молекулами и элементами цитоскелета клетки, которые необходимы нейтрофилам в период их функциональной активации, а также имеют отношение к регуляции апоптоза [4, 5, 10, 11].
Целью данного исследования являлось определение особенностей активации ядер нейтрофильных гранулоцитов периферической крови здоровых людей в норме и в условиях дополнительной активации клеток агентами бактериальной природы (стафилококковый энтеротоксин А, культура S. аureus), а также оценка степени активации ядер нейтрофилов у пациентов с язвенной болезнью двенадцати перстной кишки (ЯБ ДПК) в процессе хирургического лечения. Материалы и методы Объектом исследования являлась венозная кровь 23 условно здоровых добровольцев обоего пола в возрасте от 21 до 49 лет, а также 54 больных того же возраста, страдающих ЯБ ДПК. В две лунки планшета для иммунологических исследований помещали по 100 мкл крови, стабилизированной ЭДТА (0,5 мл 2,5% ного раствора на 9,5 мл крови). В одну лунку добавляли 100 мкл физиологического раствора (спонтанная активность клеток), в другую—100 мкл бактериальной взвеси S. aureus в концентрации 1 ? 106 микробных тел в 1 мл физиологического раствора или стафилококковый энтеротоксин А (стимулированная активность клеток). В одной из серий исследований взвесь S. аureus дополнительно разводили в соотношении 1 : 10. Инкубацию проводили в термостате при температуре 37 °С в течение 1 ч. После инкубации готовили препараткаплю на хорошо обезжиренном предметном стекле. Мазки высушивали на воздухе, фиксировали смесью этанола и ацетона (1 : 1) в течение 20 мин, подвергали гидролизу в 5 N HCl при температуре 20 °С в течение 30 мин, проводили блокаду альдегидных групп раствором гидроксиламина по Р. Лилли [3] при температуре 37 °С в течение 3 ч. Мазки окрашивали толуидиновым синим (Merck, Germany) в концентрации 0,05 % на 0,001 М цитратном буфере (рН 5,0; 20 мин). Препараты отмывали цитратным буфером, высушивали и исследовали с помощью поляризационного микроскопа «МП 8» (объектив ПЛАН АПО МИ 100 ? 1,25; окуляр К10?) при скрещенном анализаторе и поляризаторе. Для учета интенсивности анизотропного эффекта в НГ использовали модификацию полуколичественного метода Астальди и Верга, адаптированного для изучения ядер [9]. Все ядра были разделены по степени анизотропии на 5 групп, каждой из которых была присвоена определенная величина анизотропии (0—полное отсутствие; 4—анизотропно все ядро; рисунок). В дальнейшем расчет анизотропии проводился по формуле где СЦИ—средний цитохимический индекс, соответствующий величине анизотропии; a, b, c, d, e—количество клеток с разной величиной анизотропии; 0, 1, 2, 3, 4—условная степень анизотропии. Учитывая наличие обратной связи между степенью анизотропии хроматина и его биологической активностью, нами был введен показатель активности нейтрофильных гранулоцитов (ПАН), который рассчитывается по формуле ПАН = 4—Х, где 4—максимально возможный СЦИ, а Х—СЦИ, подсчитанный в конкретном мазке крови. Таким образом, чем выше анизотропия хроматина (СЦИ = Х), тем ниже активность ядра. Cтатистическую обработку полученных данных производили на компьютере IBMPC/AT с расчетом средних арифметических величин (М), их ошибок (±m), критерия достоверности Стъюдента (t, p) и коэффициента корреляции (r) [6].
Результаты и обсуждение
Анализ результатов топологического исследования ядер НГ периферической крови здоровых людей показал, что величина анизотропии , ядерного хроматина в покое составила в среднем 2,65 ± 0,11, причем большинство исследованных ядер (около 70 %) имело высокое значение анизотропного эффекта. При этом показатель активации нейтрофилов (ПАН) составил 1,35 ± 0,11. После инкубации крови in vitro со стафилококковым энтеротоксином величина анизотропного эффекта в ядрах НГ снижалась до 0,93 ± 0,04 и большинство ядер (около 60 %) имело нулевую или низкую величину анизотропного эффекта. Таким образом, инкубация крови со стафилококковым энтеротоксином приводит к снижению структурной упорядоченности хроматина ядер НГ, которая проявляется падением уровня анизотропии ядер и соответствующим ростом показателя ПАН, что свидетельствует о биологической активации хроматина этих клеток. С целью более глубокого изучения активационных возможностей ядер НГ нами была предпринята попытка смоделировать условия, способствующие возникновению активационных процессов, приближающиеся к естественным. После стимуляции НГ культурой S. aureus в концентрации 1 ? 106 клеток/мл величина анизотропии хроматина НГ снизилась на 99,63 % и составила в среднем 0,01 ± 0,005 при ПАН, равном 3,91 ± 0,005.
Степени анизотропии ядер нейтрофильных гранулоцитов: А — 4; Б — 3; В, Г — 2; Д — 1; Ж, Е — 0. Окраска толуидиновым синим при рН 5,0. Ув. об. 100?; ок. 10?
Это означает практически полное отсутствие анизотропии в ядрах стимулированных клеток, а значит, и максимальную активацию их хроматина. При этом 99 % исследованных НГ имели нулевой уровень анизотропии в ядрах.
Анализ результатов топологического исследования ядер НГ, подвергшихся стимуляции культурой S. aureus в разведении 1 : 10, показал, что уровень анизотропии хроматина этих клеток колеблется от 1,43 до 2,06 и составляет в среднем 1,76 ± 0,03, что меньше уровня контроля на 32,8 %; при этом величина ПАН составила 2,24 (p < 0,01). Такой уровень анизотропии объясняется тем, что 22,8 % ядер исследованных НГ имели нулевой уровень анизотропии в отличие от ядер нейтрофилов контрольной группы, где это значение равнялось 1,4 %. Корреляционный анализ показал, что изменение анизотропии хроматина ядер НГ после стимуляции находится в умеренной отрицательной связи с результатами, полученными до стимуляции (r = – 0,6). У больных ЯБ ДПК до планового оперативного вмешательства величина анизотропии ядер НГ колебалась от 2,09 до 2,42, составляя в среднем 2,21 ± 0,007, что на 17 % ниже, чем в ядрах аналогичных клеток лиц контрольной группы (p < 0,01). При этом величина ПАН составила 1,81 ± 0,007. В раннем послеоперационном периоде (5–7 дней после операции) величина анизотропного эффекта в ядрах НГ больных ЯБ ДПК составила в среднем 2,13 ± 0,006, при размахе индивидуальных колебаний от 1,89 до 2,09, что было ниже как по сравнению с контролем, так и с уровнем, зарегистрированным перед оперативным вмешательством (на 20 и 3 % соответственно). Величина ПАН ядер НГ достоверно возросла по отношению к исходному уровню и контролю, составив 1,87 ± 0,006 (p < 0,01). Через 1 мес. после операции в ядрах НГ больных ЯБ ДПК обнаружилось явное усиление анизотропии по сравнению с предыдущим сроком исследования: ее уровень составил в среднем 2,35±0,006, при этом показатель ПАН соответственно снизился до 1,65 ± 0,006. Данное увеличение уровня анизотропии ядер НГ на 7 % превысило исходный уровень (p < 0,05), однако величины контроля не достигло и составило 88,7 % (p < 0,001). Топологическое исследование хроматина ядер НГ больных ЯБ ДПК показало заметноеснижение величины анизотропного эффекта по сравнению с уровнем анизотропии, характерным для лиц контрольной группы. Через один месяц после операции активационная готовность ядер НГ больных ЯБ ДПК, осложненной стенозом, снижается, что свидетельствует о нормализации факторов, продуцируемых микроокружением этих клеток. Важным является тот факт, что уровень ПАН опускается ниже исходного уровня, характерного для предоперационного периода, однако значений контроля не достигает. Таким образом, в процессе изучения особенностей активационных процессов в ядре НГ у условно здоровых лиц при воздействии агентов бактериальной природы и у пациентов на различных этапах хирургического лечения ЯБ ДПК установлено дифференцированное реагирование ядерного хроматина клеток. Воздействие агентов бактериальной природы приводит к изменению структурной упорядоченности хроматина НГ пропорционально интенсивности воздействия. Динамика показателя активации нейтрофилов (ПАН) больных ЯБ ДПК свидетельствует об эффективности оперативного вмешательства. В то же время остающийся повышенным по сравнению с контролем уровень активации хроматина ядер НГ указывает на то, что оперативное лечение не устраняет патогенетических причин заболевания. В целом изучение топологических свойств хроматина нейтрофилов является важным элементом в определении функциональной активности клеток в норме, патологии и эксперименте. Выводы 1. В системе in vitro выявлена зависимость степени активации ядер НГ здоровых субъектов от дозы бактериального антигена: чем выше его концентрация, тем более выражена степень активации ядер. 2. Установлено, что при ЯБ ДПК, осложненной стенозом, наблюдается активация хроматина ядер НГ; уровень активации возрастает на фоне операционного стресса и возвращается к предоперационному уровню после проведения эрадикационной терапии, не достигая контрольных параметров.
ЛИТЕРАТУРА
1. Авдеева М.Г., Евглевский А.А., Мойсова Д.Л., Шубич М.Г. Анизотропия хроматина лейкоцитов у больных лептоспирозом // Клин. лаб. диагностика. — 1997. — № 11. — С. 36–38.
2. Евглевский А.А. Способ прогнозирования течения раневого процесса. Па тент на изобретение № 2146367. — М., 2000.
3. Лилли Р. Патологическая техника и практическая гистохимия. — М.: Мир, 1969. — 648 с. 4. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. — Новосибирск: Наука, 1983. — 256 с.
5. Маянский А. Н., Маянский Н. А., Заславская М. И. и др. Апоптоз нейтpофилов // Иммунология. — 1999. — № 6. — С. 11–19.
6. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических исследованиях. — М.: Медицина, 1975. — 259 c.
7. Фрейвальдс Т. Функциональная морфология органов в патологии. — Рига, 1986. — С. 87–90.
8. Эренпрейса Е.А., Сондоре О.Ю. Связь феномена ядерной ахромазии с активацией клеток к пролиферации // Экспер. онкология. — 1989. — Т. 11. — С. 61–63.
9. Astaldi G., Verga L. The glycogen content of the cells of lymphatic leukaemia // Acta haematol. — 1957. — Vol. 17. — P. 911–928.
10. Girard D., Paquin R., Beaulieu A.D. Responsiveness of human neutrophIL-s to interleukin 4: induction of cytoskeletal rearrangements, de novo protein synthesis and delay of apoptosis // Biochem. J. — 1997. — Vol. 325. — P. 147–153.
11. Jost C.R., Huizinga T.W., de Goede R. et al. Intracellular localization and de novo synthesis of FcRIII in human neutrophgranulocytes // Blood. — 1990. — Vol. 75, № 1. — P. 144–151.
12. Erenpreiss J., Bars J., Lipatnikova V. et al. Comparative study of cytochemical tests for sperm chromatin integrity // J. Androl. — 2001. — Vol. 22, № 1. — P. 45–53.
Peculiarities of activation potential of neutrophgranulocytes’ nuclei in normal and pathologic conditions I.V. Nesterova , A.A. Evglevskiy , E.V. Fomicheva , V.V. Parfenov Training and Scientific Center of Medical Center of the Russian Federation President Affairs, Moscow; Department of Histology of Kuban State Medical Academy, Krasnodar; Russian Center for Functional Surgical Gastroenterology, Krasnodar; N.F. Gamaleya Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow
The chromatin activity of resting and S. aureus activated peripheral blood neutrophs’ nuclei of healthy persons and patients with duodenal ulcer undergoing surgical treatment was studied using polarization microscopy after cell staining with toluidine blue (pH 5.0). In healthy donors of control group, the degree of neutrophIL-s’ nuclei activation depended on the dose of S. aureus: the higher was the dose of S. aureus the higher was the degree of nuclei activation. In patients with duodenal ulcer complicated with stenosis, the resting neutrophs contained «spontaneously» activated nuclei; the degree of their activation increased further after surgery and declined thereafter towards pre)operation level however not reaching the level of healthy group.
(Cytokines and Inflammation. 2004. Vol. 3, № 2. P. 52–55.)
