С.А. Ляликов , Л.Л. Гаврилик , Т.И. Ровбуть , М. Собеска , Н.М. Клочко Государственный медицинский университет, г. Гродно, Беларусь; Медицинская академия, г. Познань, Республика Польша Антиоксидантная активность белков острой фазы у детей в зависимости от йодной обеспеченности
С.А. Ляликов , Л.Л. Гаврилик , Т.И. Ровбуть , М. Собеска , Н.М. Клочко Государственный медицинский университет, г. Гродно, Беларусь; Медицинская академия, г. Познань, Республика Польша Антиоксидантная активность белков острой фазы у детей в зависимости от йодной обеспеченности
C целью изучения связи свободнорадикальных окислительных процессов и белков острой фазы (БОФ) в условиях йодного дефицита у 104 детей определяли содержание йода в моче, а также сывороточную концентрацию C реактивного белка, ?1.кислого гликопротеина (AGP), ?1.анти. химотрипсина (ACT), антитрипсина, гаптоглобина, ?2.макроглобулина, церулоплазмина, трансферрина, малонового диальдегида, оснований Шиффадиеновых конъюгатов, кетотриеновых кетонов, общего йода гормонов гипофизарнотиреоидной системы, а также характер микрогетерогенности AGP и ACT. Установлено, что йодная обеспеченность оказывает прямое (не опосредованное гормонами щитовидной железы) влияние на продукцию и микрогетерогенность большинства изученных БОФ. Низкая концентрация йода в моче ассоциирована с пониженным содержанием AGP и ACT (причем преимущественно за счет уменьшения высокогликозилированных вариантов этих БОФ), снижением сывороточной концентрации церулоплазмина, гаптоглобина, ?1 антитрипсина. Уровень йода достоверно положительно связан с величиной сывороточной концентрации диеновых и кетоновых коньюгатов и отрицательно — с содержанием оснований Шиффа. То., при дефиците йода в организме происходит интенсификация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), о чем свидетельствует увеличение конечных продуктов ПОЛ. Вероятно, это происходит за счет изменения активности внеклеточной антиоксидантной системы: уменьшения концентрации белков острой фазы воспаления и изменения их микрогетерогенности. (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 4. С. 36–41.)
Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов (ПОЛ) — неотъемлемая часть многих жизненно важных процессов, таких как постоянное обновление липидного состава клеточных мембран и поддержание активности липидзависимых и связанных с мембраной рецепторов, синтез предшественников простагландинов, окислительное фосфорилирование в митохондриях, фагоцитоз и др. Однако избыточное образование продуктов ПОЛ ведет к накоплению перекисей липидов. Перекисные радикалы вступают во взаимодействие с молекулами жирных кислот, образуя высокотоксичные гидроперекиси и новый свободный радикал. Этот процесс, протекая лавинообразно, может привести к быстрому разрушению клеточных структур. В патогенезе многих заболеваний лежит нарушение равновесия между процессами образования и нейтрализации продуктов ПОЛ [3]. Однако в норме это не происходит благодаря наличию многокомпонентной антиоксидантной системы, способной ингибировать свободнорадикальное окисление липидов. Важным компонентом внеклеточной антиоксидантной системы являются белки острой фазы воспаления (БОФ). Эти белки представляют собой наиболее древнюю форму неспецифической иммунобиологической защиты организма и являются одной из важных систем иммунного гомеостаза. В настоящее время к группе БОФ относят более 30 различных белков. Среди них выделяют транспортные белки (трансферрин, церулоплазмин, гаптоглобин), неспецифические ингибиторы сывороточных протеаз (?1 антитрипсин, ?1 антихимотрипсин, ?2 макроглобулин), белки системы комплемента (С3, и С4), С реактивный белок, ?1 кислый гликопротеид, сывороточный амилоид А, фибриноген и др. Значительная часть этих белков образуется в гепатоцитах и макрофагах под влиянием глюкокортикоидов, IL1 и IL6 в ответ на инфекционные агенты, токсины, при аутоиммунных состояниях, аллергических и онкологических заболеваниях. За исключением С реактивного белка, сывороточного компонента амилоида А и альбумина все БОФ являются гликопротеинами. В их состав кроме белковой части входят две, три или четыре боковые олигосахаридные цепи, называемые антеннами. Молекулы одного и того же гликопротеина различаются по количеству антенн (разноантенарные варианты), это явление называется микрогетерогенностью. В физиологических условиях для каждого гликопротеина количественное соотношение вариантов молекул является постоянной величиной. В литературе имеются очень немногочисленные сведения о связи микрогетерогенности с патологией. Практически все они касаются посттрансляционных изменений структуры боковых олигосахаридных цепей в ходе воспаления под действием цитокинов (IL6, TGF, TNF) [8]. Мы не нашли данных о связи между характером микрогетерогенности и йодной обеспеченностью, хотя известно, что дефицит йода в организме обуславливает развитие целого ряда патологических состояний, т.н. йододефицитных заболеваний. Йод—эссенциальный микроэлемент, входящий в состав гормонов щитовидной железы. В желудочно-кишечный тракт он поступает в виде йодида и пополняет количество неорганического йода во внеклеточной жидкости. Циркулирующий в крови йод попадает в щитовидную железу и другие органы (слизистую оболочку желудка, слюнные железы, почки, молочную железу и др.), незначительно депонируется в жировой ткани. Тиреотропный гормон стимулирует все этапы биосинтеза тиреоидных гормонов: захват йодидов из крови щитовидной железой, окисление и органификацию йодида, конверсию тироксина в трийодтиронин. Перекисные процессы играют важную роль при органификации йода, в свою очередь гормоны щитовидной железы способны влиять на интенсивность ПОЛ, причем, по данным литературы, их относят, как к про, так и к антиоксидантам [1, 11, 13]. В условиях дефицита йода происходит ослабление синтеза и секреции гормонов щитовидной железы и активация секреции тиреотропного гормона, однако мы не встретили работ о взаимоотношениях свободнорадикальных окислительных процессов и внеклеточных антиоксидантов—БОФ в условиях йодного дефицита, а также данных о том, как характер микрогетерогенности этих белков влияет на их антиоксидантную активность. Изучение этих вопросов явилось целью данной работы.
Материалы и методы
В ходе работы было обследовано 104 ребенка (52 девочки и 52 мальчика), 49 в возрасте от 7 до 12 лет, 55—от 12 до 15 лет. Дети на момент обследования не имели клинических признаков тиреоидной патологии, острых инфекций и обострения хронических заболеваний. Содержание йода определяли в утренней порции мочи. Обязательным требованием было — сбор мочи натощак. Исследование проводили церийарсенитным методом [10]. В зависимости от степени обеспеченности организма йодом, все обследованные были распределены на 3 группы. В 1 ю группу вошло 53 ребенка с концентрацией йода в моче менее 100 мкг/л, во 2 ю — 33 с уровнем экскреции от 100 до 300 мкг/л и в 3 ю — 18 детей, у которых содержание йода в моче превышало 300 мкг/л. Параллельно с взятием мочи натощак, в тот же временной период (с 7.30 до 8.30 утра), из периферической вены производился забор крови. Сывороточную концентрацию тироксина (Т4), трийодтиронина (Т3), тиреотропного гормона (TSH) исследовали радиоиммунным методом (фирма «БЕЛОРИС», Беларусь). Содержание белков острой фазы—C реактивного белка (CRP), ?1 кислого гликопротеина (орозомукоида или AGP), ?1 антихимотрипсина (ACT), антитрипсина (AT), гаптоглобина (HP), ?2 макроглобулина (А24MG), церулоплазмина (CP) и трансферрина (Tf) определяли методом ракетного иммуноэлектрофореза по Laurell [7] (использовались антитела и стандартный раствор сыворотки производства «Dakopatts», Denmark). С помощью перекрестного аффинного иммуноэлектрофореза по Bog Hansen [5] в модификации Mackiewizca [8] по реакции с конканавалином А (Con A, «Sigma») исследова4 ли микрогетерогенность AGP, ACT и Tf. Коэффициенты реак4 тивности (AGP–RC и ACT–RC) рассчитывали по формулам: AGP–RC = (W1+W2+W3)/W0, где W1, W2 и W3—варианты AGP, реагирующие с Con A, W0—вариант AGP, не реагирующий с Con A; ACT–RC = (A2+A3+A4+A5)/A1, где A2 A3, A4 и A5—варианты ACT, реагирующие с Con A, A1—вариант ACT, не реагирующий с Con A. Содержание в сыворотке крови общего йода исследовали церийарсенитным методом, малонового диальдегида (МД)— спектрофотометрически в реакции с тиобарбитуровой кислотой. Содержание основания Шиффа (ОШ) оценивали по интенсивности флуоресценции в хлороформной фазе (метод Fletcher B.L. et al., 1973), уровень диеновых конъюгатов (ДК) и кетотриеновых кетонов (КК) определяли по величине оптической плотности [12]. Статистическую обработку результатов исследования производили с использованием пакета прикладных статистических программ «Statistica 6.0».
Результаты и обсуждение
Установлено, что концентрация CRP практически не различалась у представителей сравниваемых групп и у всех детей была значительно ниже верхней границы нормы, что можно расценивать как лабораторное подтверждение клинического заключения об отсутствии острых воспалительных процессов у обследованных. Большинство других изученных белков острой фазы воспаления значимо связаны с показателем обеспеченности организма йодом. Так, содержание AGP в сыворотке крови у обследованных из 1 й группы достоверно ниже, чем во 2 й и 3 й группах (табл. 1). Наряду со снижением концентрации AGP, у лиц с низкой обеспеченностью йодом выявлены существенные изменения качественного состава этого гликопротеина, которые заключаются в уменьшении доли высокогликозилированного варианта AGP W0 и увеличении низкогликозилированных вариантов W1 и W2. Снижение интенсивности гликозилирования у представителей 1 й группы закономерно отразилосьна величине показателя AGP RC — при йододефиците этот коэффициент существенно выше, чем во 2 й группе. Представляет интерес взаимоотношение вариантов AGP и показателей, характеризующих перекисные процессы в организме при различной обеспеченности йодом. С помощью корреляционного анализа установлено, что у детей второй группы первичные продукты ПОЛ— диеновые конъюгаты положительно коррелируют с высокогликозилированными вариантами AGP и отрицательно—с низкогликозилированными (табл. 2). Аналогичным образом связаны варианты AGP с кетотриеновыми кетонами, причем с W0 КК коррелируют достоверно положительно, а с W3 — достоверно отрицательно. Конечный продукт ПОЛ — основание Шиффа находится в отрицательной связи с высокогликозилированными вариантами AGP и положительной— с низкогликозилированными, причем общее содержание орозомукоида достоверно отрицательно коррелирует с ОШ. При йододефиците характер связей между изученными продуктами ПОЛ и вариантами AGP значительно изменяется (табл. 3). Первичные продукты ПОЛ коррелируют с низкогликозилированными вариантами AGP положительно, а с W0 — отрицательно. Противоположная направленность связей имеет место между этими вариантами кислого гликопротеида и дальнейшими продуктами ПОЛ. Сам AGP у детей с йододефицитом, также как и во 2 й группе, положительно коррелирует с диеновыми коньъюгатами и кетотриеновыми кетонами и отрицательно—с основанием Шиффа, однако связь с первичными продуктами ПОЛ в 1 й группе достоверная, а с конечным продуктом—статистически незначимая. С помощью кластерного анализа установлено, что при нормальной обеспеченности йодом W2 вариант AGP образует кластер с основанием
Таблица 1 Уровень AGP и его вариантов в сыворотке в зависимости от обеспеченности йодом (M ± ?)
Таблица 2 Связь между AGP и его вариантами и продуктами ПОЛ (коэффициенты ранговой корреляции Спирмена) у детей с нормальной обеспеченностью йодом (n = 14)
Примечание. Здесь и далее * — p < 0,05; ** — p < 0,01.
Таблица 3 Связь между AGP и его вариантами и продуктами ПОЛ (коэффициенты ранговой корреляции Спирмена) у детей с йододефицитом (n = 49)
Шиффа (дистанция меньше 0,4), кетотриеновые кетоны с W0 образуют тесный кластер, к которому последовательно присоединяются диеновые коньъюгаты и W1 вариант AGP (рис. 1). У детей с йододефицитом взаимосвязи между вариантами AGP и продуктами ПОЛ практически отсутствуют (рис. 2). Варианты AGP, за исключением W0, сгруппированной с малоновым диальдегидом, образуют автономный кластер (дистанция больше 0,8), причем дистанция между основанием Шиффа и кластерами, включающими продукты ПОЛ, превышает 0,8. В живых организмах в процессе биологического окисления постоянно образуются различные активные формы кислорода (АФК) [6]. Продукты перекисного окисления липидов образуются в цитоплазматической мембране в результате воздействия на клетку АФК. Учитывая полученные данные, можно предположить, что при нормальной обеспеченности йодом увеличение образования первичных продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и кетотриеновых кетонов) на мембране клетки сопровождается увеличением синтеза орозомукоида и активацией процесса его гликозилирования в аппарате Гольджи. В результате—повышается доля высокогликозилированных вариантов AGP параллельно со снижением процента низкогликозилированных вариантов. Наличие отрицательной связи между сывороточным содержанием кислого гликопротеида и конечного продукта ПОЛ объясняется антиоксидантным эффектом AGP, секретируемого клетками, и проявляется снижением основания Шиффа на фоне увеличения AGP. В условиях дефицита йода взаимосвязь между процессами ПОЛ и темпами гликозилирования ораозомукоида нарушается. Увеличение первичных продуктов ПОЛ в меньшей степени, чем в норме, но все же способствует повышению синтеза AGP, однако образование высокогликозилированных вариантов при этом не увеличивается. Вероятно, изменение микрогетерогенности сказывается на антиоксидантной активности AGP, это иллюстрируется отсутствием статистической достоверности между конечным продуктом ПОЛ и уровнем орозомукоида. Значение микрогетерогенности AGP как фактора, влияющего на эффективность антиоксидантной защиты, подтверждается появлением достоверной отрицательной связи между показателем AGPRC (отношением низкогликозилированных вариантов к W0) и основанием Шиффа. Различая концентрации ACT в сыворотке крови и распределение его вариантов у представителей различных групп в целом такие же, как и AGP (табл. 4). У лиц с йододефицитом существенно уменьшено общее содержание ACT, имеется достоверное снижение доли высокогликозилированного варианта А1 на фоне значительного повышения процента А3—представителя низкогликозилированных вариантов. Несмотря на то, что доля вариантов ACT А4 и А5 в 1 й группе меньше, чем во 2 й, у детей с низкой экскрецией йода наблюдается заметная тенденция к увеличению коэффициента ACTRC. Средний уровень трансферрина и процент его вариантов Т1 и Т2 в 1 й группе несколько ниже, чем во 2 й и 3 й, однако различия статистически не достоверны. Концентрации церулоплазмина, гаптоглобина и ?1 антитрипсина в сыворотке крови детей прямо пропорционально связаны с обеспеченностью йодом. Причем в 1 й группе содержание этих белков несколько ниже нормы, а в 3 й — выше. Следует отметить, что между сывороточным содержанием всех изученных нами БОФ и уровнем йодной экскреции имеется практически линейная зависимость. Концентрация йода в крови (но не общего Т4 и Т3) с высокой степенью достоверности положительно коррелирует с содержанием диеновых коньъюгатов (rSpearman = 0,28; p = 0,04),
Рис. 1. Результат кластерного анализа продуктов ПОЛ и вариантов AGP при нормальной обеспеченности йодом
Рис. 2. Результат кластерного анализа продуктов ПОЛ и вариантов AGP при йодо дефиците
кетоновых конъюгатов (rSpearman = 0,30; p = 0,03) и отрицательно—с сывороточной концентрацией оснований Шиффа (rSpearman = –0,29; p = 0,03). У лиц с более низкой концентрацией йода в крови существенно повышен уровень оснований Шиффа (Kruskal Wallis test: H = 8,63; p = 0,013). Т.о., большинство исследованных нами белков острой фазы воспаления значимо связаны с показателем обеспеченности организма йодом. Низкая концентрация йода в моче ассоциирована с пониженным содержанием AGP и ACT, причем преимущественно за счет уменьшения высокогликозилированных вариантов этих БОФ, снижением сывороточной концентрации церулоплазмина, гаптоглобина, ?1 антитрипсина. Высокий уровень йода в организме сопровождается ростом сывороточного содержания церулоплазмина и гаптоглобина. Диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид и кетоновые конъюгаты, основания Шиффа являются последовательными звеньями одной цепи перекисного окисления [2]. При недостаточном поступлении йода в организм развиваются количественные и качественные изменения белков острой фазы воспаления, обладающих антиоксидантными свойствами, разобщаются связи между продукцией БОФ и синтезом промежуточных продуктов ПОЛ. Вследствие этого увеличивается интенсивность процессов перекисного окисления и происходит накопление конечных продуктов ПОЛ. Работа выполнена при поддержке общественной экологической организации «Green Cross».
Таблица 4 Сывороточное содержание ACT, Tf и их вариантов, а также A2.MG, CP, HP и AT у детей в зависимости от обеспеченности йодом (M ± ?)
ЛИТЕРАТУРА 1. Городецкая И.В., Божко А.П. Значение малых доз экзогенных тиреоидных гормонов в сохранении свободнорадикального гомеостаза миокарда и тиреоидного статуса в условиях антагонистических стрессов// Здравоохранение. — 2000. — № 1. — С. 13–15.
2. Камышников В.С. Справочник по клиникобиохимической лабораторной диагностике. — Мн.: Беларусь, 2000. — Т. 2. — 463 с.
3. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при заболеваниях сердечно4сосудистой системы. — М., 2000. — 430 с.
4. Bierhuizen M.F., De Wit M., Govers C.A. et al. Glycosylation of three molecular forms of human alpha 14acid glycoprotein having different interactions with concanavalin A. Variations in the occurrence of di4, triand tetraantennary glycans and the degree of sialylation // Eur. J. Biochem. — 1988. — Vol. 175, № 2. — P. 387–394.
5. Bog4Hansen T.C. Crossed immuno4affinoelectrophoresis. An analytical method to predict the result of affinity chromatography // Anal. Biochem. — 1973. — Vol. 56, № 2. — P. 480–488.
6. Davies K.J. Oxidative stress: the paradox of aerobic life // Biochem. Soc. Symp. — 1995. — Vol. 61. — P. 1–31.
7. Laurell C.B.Electroimmunoassay // Scand. J. Clin. Lab. Invest. — 1972. — Vol. 29, Suppl. 124. — P. 21–28.
8. Mackiewicz A., Kushner I. Affinity electrophoresis for studies of mechanisms regulating glycosylation of plasma proteins // Electrophoresis. — 1989. — Vol. 10, № 12. — P. 830–835.
9. Mackiewicz A., Mackiewicz S. Determination of lectin4sugar dissociation con4 stants by agarose affinity electrophoresis // Anal. Biochem. — 1986. — Vol. 156, № 2. — P. 481–488.
10. Dunn J.T, Crutchfield H.E., Gutekunst R., Dunn A.N. Methods for measuring iodine in urine. International Council for control of Iodine deficiency Disor4 des. — Netherlands, 1993. — P. 18–29.
11. Petrovic V. M., Spasic M., Saicic Z., Milic R., Radijicic R. Increase in superoxide dismutase activity induced by thyroid hormones in the brains of neonate and adult rats // Experientia. — 1982. — Vol. 38. — P. 1355–1356.
12. Recknagel R.O., Ghoshal A.K. Lipoperoxidation of rat liver microsomal lipids induced by carbon tetrachloride // Nature. — 1966. — Vol. 210. — P. 1162–1163.
13. Tseng J., Latham K. R. Iodothyronines: oxidative diodination by hemoglobin and inhibition of lipid peroxidation // Lipids. — 1984. — Vol. 19. — P. 96–102.
Antioxidative activity of acute phase proteins in children is dependent on iodine provision S.A. Lialikov , L.L. Gavrilik , T.I. Rovbut , М. Sobieska , N.М. Klachko State Medical University, Grodno, Belarus; University of Medical Sciences, Poznan, Poland
The aim of the study was to estimate relation between lipid oxidation by free radicals and acute phase proteins (APP) depending on iodine provision. C.reactive protein, ?1.acid glycoprotein (AGP), ?1.antichymotrypsin (ACT), transferrin, ceruloplasmin, haptoglobin, ?1.antitrypsin, ?2.macroglob. ulin, thyroxin, triiodothyronin, thyrotropic hormone, malonic dialdehyde, Schiff base, dienic conju. gates, ketotrienic ketons and microheterogeneity of AGP and ACT, were examined in 104 children. It was determined, that iodine provision influenced directly (not through thyroid hormones) on output and microheterogeneity of acute phase proteins. Iodine deficiency was associated with decreased AGP, ACT, along with altered glycosylation of those glycoproteins and low level of ? ? ? ? ?1.antitrypsin, cerulo. plasmin, haptoglobin in serum. Iodine concentration positively correlated with dienic and keton conju. gates and negatively with Schiff base, with high significance. Thus, the low iodine provision resulted in increased intensity of lipid oxidation. Probably it is caused by decrease of the APP concentration and their microheterogeneity. (Cytokines and Inflammation. 2004. Vol. 3, № 4. P. 36–41.)
