О.А. Громова , Н.Ю. Сотникова, , С.И. Катаев , А.Н. Галустян , Л.М. Красных , С.В. Мазина ГОУ ВПО Ивановская государственная медицинская академия МЗ РФ, Иваново; ГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова МЗ РФ», Иваново; ГФУ Институт клинической фармакологии НЦЭСМП МЗ РФ, Москва Протективная роль церебролизининдуцированной экспрессии генов металлотионеина I и металлотионеина II при церебральной очаговой ишемии у крыс
О.А. Громова , Н.Ю. Сотникова, , С.И. Катаев , А.Н. Галустян , Л.М. Красных , С.В. Мазина ГОУ ВПО Ивановская государственная медицинская академия МЗ РФ, Иваново; ГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова МЗ РФ», Иваново; ГФУ Институт клинической фармакологии НЦЭСМП МЗ РФ, Москва Протективная роль церебролизининдуцированной экспрессии генов металлотионеина I и металлотионеина II при церебральной очаговой ишемии у крыс
Церебролизин (FPF1070) известен как препарат, обладающий нейропротективными, антиоксидантными и нейротрофическими свойствами. Многочисленные фармакодинамические эффекты Церебролизина обусловлены присутствием в препарате низкомолекулярной фракции пептидов и L аминокислот. Клиническая эффективность Церебролизина при ишемии мозга была продемонстрирована в нескольких исследованиях, однако точные молекулярные механизмы, отвечающие за нейропротективный эффект препарата остаются слабоизученными. Металлотионеины (МТ) представляют собой низкомолекулярные цистеинсодержащие белки, участвующие в развитии антиоксидантного ответа и связывании ионов металлов. Целью данного исследования было обнаружение способности FPF1070 стимулировать продукцию МТ1 в коре головного мозга крыс при экспериментальной транзиторной очаговой ишемии. Транзиторная очаговая ишемия вызывалась 30минутной окклюзией общей сонной и правой средней мозговой артерий. Экспериментальной группе крыс вводился FPF1070 в дозе 10 мкг/г веса внутривенно за 1 час до начала окклюзии артерий. В коре головного мозга крыс, подвергавшихся ишемии, уровень мРНК МТ 1, определявшихся с помощью количественной полимеразной цепной реакции увеличился в 8, а МТ2 — в 7,8 раз. При введении FPF1070 уровень МТ1 возрастал в 16,2 раз, МТ2 — в 16,5 раза. Данные результаты свидетельствуют о том, что нейропротективый механизм действия Церебролизина при ишемии мозга обусловлен повышенной продукцией нескольких белков, включая MT1. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 42–46.)
Токсичные металлы и гены, которые они индуцируют, ассоциируются с клеточной гибелью и окислительным стрессом. Биологические системы выработали различные защитные пути. Одним из вариантов такой защиты являются металлотионеины (МТ), способные утилизировать и аккумулировать тяжелые металлы [20]. МТ— это богатые цистеином низкомолекулярные протеины с плейотропными функциями [20]. В настоящий момент у человека известно 4 класса МТ, насчитывающие 16 изоформ [20]. МТ имеют молекулярную массу до 6–7 кДа и способны связывать широкий спектр металлов, в том числе и токсичных (Pb, Cd) [14]. Металлы индуцируют экспрессию этих белков в различных тканях (мозг, печень, миокард и т.д.). Помимо металлов, МТ индуцируются стероидами укрыс [15], канцерогенами у мышей [6], химическими веществами, вызывающими окислительный стресс у грызунов [11], ионизирующей радиацией [8] и УФО [18]. Индукция МТ1 не происходит в присутствии ЭДТА, при отсутствии в культуральной среде цинка или при нарушении транспорта цинка внутрь клетки. В экспериментах на животных было показано, что МТ индуцируются провоспалительными цитокинами [5]. Индукция МТ1 мРНК не зависит от белкового синтеза и коррелирует с окислительно восстановительными функциями антиоксидантов. Исследования последних лет показали, что МТ могут играть важную роль в антиоксидантной защите [6]. Большое число исследований свидетельствует о прямом участии МТ в защите различных тканей от повреждающего действия металлов и окислительного стресса [19]. Феноловые антиоксиданты активируют транскрипцию МТ1 за счет цинкзависимого механизма, в котором основным является связывание MTF1 (активируемого металлами транскрипционного фактора) с металлорегулируемыми структурами промотора гена МТ1 [7]. Если МТ не индуцируются, защита тканей и, в частности, мозга от тяжелых металлов значительно нарушается, и возрастает чувствительность тканей к действию окислительнострессовых факторов [16]. Считается, что они играют важную роль и в туморогенезе [21]. Экспрессия мРНК МТ в клетках трофобласта человека защищает последние от индуцированного кадмием апоптоза за счет увеличения времени поступления Са2 внутрь клетки [17]. Показано также, что экспрессия МТ ассоциируется с более благоприятным вариантом функционирования трансплантатов сердца. При этом существует прямая корреляционная связь между уровнем IL6 и обратная—с уровнем IL2 и экспрессией МТ [5]. К сожалению, исследования, посвященные микроэлементному составу мозга и МТ в мозге, единичны. Получены данные, свидетельствующие о том, что у человека ионизирующая радиация индуцирует в ЦНС как протеин МТ, так и экспрессию мРНК МТ2. Однако индукция синтеза МТ цинком защищает мозг от повреждающего действия радиации [8]. Целью данного исследования было изучить влияние FPF1070 на продукцию МТ1 и МТ2 в коре головного мозга крыс на модели транзиторной очаговой ишемии.
Материалы и методы
Исследование проводили на 60 белых крысах со средним весом 189±3,2 г. Возраст животных на время эксперимента составил 3–5 мес. Все животные содержались на стандартной диете, со свободным доступом к воде, в изолированных клетках и не использовались в течение всей жизни ни в каких других экспериментальных работах. Было выделено 3 группы животных. 20 интактных крыс служили в качестве группы контроля (10я группа). У 20 животных опытной группы (20я группа) вызывали транзиторную очаговую ишемию путем создания 300минутной окклюзии общей сонной и правой средней мозговой артерий. 20 крысам 30й группы за 1 час до начала окклюзии артерий вводили Церебролизин в дозе 10 мкг/г веса внутривенно. По окончании исследования животные были умерщвлены под гексеналовым наркозом, и головной мозг был извлечен из полости черепа по стандартной методике. Последняя операция заключалась в рассечении браншами ножниц костей черепа по границе между ее основанием и сводом. После отделения свода черепа вместе с твердой мозговой оболочкойперерезали черепные нервы. Мозг извлекали и помещали в чашку Петри, после чего производили срезы кусочков ткани коры мозга толщиной 1–1,5 мм весом до 500 мг в зоне, кровоснабжающейся из бассейна правой средней мозговой артерии, по стандартной методике [3]. Полученные образцы сразу же подвергали замораживанию в жидком азоте и сохраняли в маркированных пакетах до момента проведения RT0PCR исследования. Общую РНК, обогащенную мРНК, выделяли из ткани коры крыс одноэтапным методом [9] с помощью готовых для использования реагентов (RNA STAT060, Tel Test B, Friendswood TX, USA), включавших фенол и тиоцианат гуанидина в монофазном растворе. Ткань коры головного мозга крыс (200 мг) гомогенизировали в денатурирующем растворе (2 мл) в стекляннотефлоновом тканевом гомогенизаторе. Гомогенат смешивали с ацетатом натрия (2 M; 0,2 мл), насыщенным водой фенолом (2 мл) и смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (49:1; 0,4 мл). После инкубации в течение 15 минут при температуре 4 °C и центрифугирования при 9500 об./мин в течение 20 мин при 4 °C общую РНК осаждали 100%ным изопропано0 лом при –20 °C. РНК ресуспендировали в DEPCобработанной воде и хранили при –70 °C до анализа. Для удаления остаточной геномной ДНК изолят обрабатывали свободной от РНКазы ДНК азой RQ1 (Promega, Madison, WI, USA). Качество выделенной РНК оценивали по наличию рибосомальной 18S РНК. Обратную транскрипцию для получения кДНК проводили стандартным методом [10] в конечном растворе, содержащем 0,2 мМ каждого d нуклеотидтрифосфата, 10 мкМ праймеров в буфере и Taq ДНК0полимеразу (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Для обратной транскрипции использовали общую РНК (2 мкг). Конечную кДНК, 2 мл которой эквивалентно 0,2 мкг общей РНК, амплифицировали. Методику RT0PCR в реальном масштабе времени проводили по описанной ранее методике [10] с помощью термосайклера GeneAmp 5700 (Applied Biosystems, USA), в соответствии с инструкциями производителя (один цикл при 50 °С—2 мин, один цикл при 95 °С—10 мин, 40 циклов при 95 °С—15 сек. и 60 °С—1 мин). Каждый образец содержал 12,5 мкл готового 2 ? Master mix, 1,5 мкл соответственно разведенного флюоресцентного красителя Syber green и пару праймеров МТ10МТ2 в конечной концентрации 0,8 мкМ для каждого праймера и 1 мкл кДНК. ПЦР проводили в трех повторах в 960 луночных планшетах. Каждый планшет имел отрицательный и положительный контроль. В качестве внутреннего контроля использовали GAPDH, по отношению к которому нормализовали транскрипты МТ01 и МТ02. Пороговую флюоресценцию во всех случаях определяли, исходя из средней флюоресценции от всех образцов для циклов 3–15 [10]. Последовательности праймеров представлены в табл. 1. В качестве негативного контроля при каждой
Таблица 1 Последовательность праймеров для полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени
амплификации использовали образцы, не содержащие кДНК или праймеры. В качестве внутреннего контроля использовали GAPDH. Нормализацию данных проводили по отношению к уровню экспрессии РНК у интактных крыс. Препаратом выбора для исследования был Церебролизин. Он (FPF01070) используется в качестве препарата с нейропротективным, антиоксидантным и нейротрофическим эффектами. Фармакодинамические эффекты Церебролизина в мозге обусловлены присутствием низкомолекулярной фракции нейропептидов и L аминокислот. Совокупность терапевтических эффектов Церебролизина определяется мембрано стабилизирующим, ростостимулирующим и метаболическим влиянием препарата. В последние годы появились данные о роли Церебролизина в стабилизации металлолигандного гомеостаза в мозге [1, 2]. Некоторые нейропептиды, в частности, фактор роста нервов (NGF), и аминокислоты способны формировать компактные комплексы с цинком, которые облегчают трансмембранный транспорт и усиливают аффинитет взаимодействия лиганда с рецепторными молекулами. Цинк является компонентом более 1000 внутриклеточных белков и ферментов и играет значительную роль в предупреждении нейродегенеративных процессов и апоптоза нейронов [2]. Статистическую обработку материала проводили с помощью программы Statistica.
Результаты и обсуждение
Уровень экспрессии МТ1 И МТ2 оценивали как n кратные величины после нормализации относительно ? актина.
Результаты эксперимента представлены на рис. 1. В коре головного мозга интактных крыс определялась незначительная экспрессия МТ1 и МТ2. У крыс, подвергавшихся ишемии, уровень мРНК МТ1, определявшихся с помощью количественной полимеразной цепной реакции, увеличился в 8, а МТ2— в 7,8 раза. При введении FPF1070 уровень МТ1 возрастал в 16,2 раза, МТ2—в 16,5 раза. Полученные результаты свидетельствуют о том, что действие Церебролизина сходно с действием цинка. Chan P.C. et al. (2004) описали 20 кратное увеличение под воздействием цинка уровня экспрессии МТ1 в гепатоцитах [9].
Рис. 1. Динамика продукции металлотионеинов и при церебральной очаговой ишемии и после введения Церебролизина
Известно, что FPF 1070 содержит макро и микроэлементы, в том числе цинк. Возможно, это обусловлено большим содержанием цинка в Церебролизине [2]. При этом элементный состав Церебролизина зависит не только от технологии изготовления, но и является следствием генетической и/или эволюционной трансформации элементов в мозге—биосубстрате для получения лекарства, и может играть важную роль в реализации их нейротрофического эффекта. Предыдущие исследования, проведенные методом массспектрометрии и атомной эмиссионной спектрометрии с индукционно связанной плазмой, выявили в нейропротекторах природного происхождения (Церебролизине, актовегине, билобиле) не только целый спектр макро и микроэлементов [1]; высокую общую активность супероксиддисмутаз in vitro [2] и in vivo [4]. Ввиду того, что в Церебролизине наряду с аминокислотами и нейропептидами присутствует гамма макро и микроэлементов, потенциальные возможности препарата в осуществлении нейропротекторных функций становятся более понятными [2]. Церебролизин защищает нейроны от нейротоксичного воздействия свободного железа [13], от эксайтотоксичности и активации перекисного окисления липидов при мутации аполипопротеина Е [12, 22]. Полученные новые результаты свидетельствуют о том, что нейропротективый механизм действия Церебролизина при ишемии мозга может быть обусловлен, в частности, повышенной продукцией MT. Можно предположить следующие наиболее вероятные металлолигандные механизмы нейропротекции при действии препарата Церебролизин. С одной стороны, повышенная под действием Церебролизина экспрессия мРНК МТ1 и МТ2 в клетках мозга замедляет кальциевый каскад эксайтотоксичности за счет увеличения времени поступления ионов Са2 в нейроны и клетки глии, что обеспечивает быструю фазу нейропротекторного эффекта и уменьшение зоны инфаркта в модели транзиторной очаговой ишемия путем создания 30 минутной окклюзии общей сонной и правой средней мозговой артерий. Кроме того, под влиянием введения FPF1070 и обусловленной этим индукции МТ повышается способность мозговой ткани утилизировать и аккумулировать тяжелые металлы, что снижает их токсическое воздействие на мозг, повышает устойчивость мозга к повреждающему действию радиации, что, возможно, обеспечивает накопительный профилактический нейропротекторный эффект Церебролизина. Кроме того, усиление синтеза МТ способствует элиминации свободных радикалов, за счет чего может снижаться выраженность повреждающего эффекта ишемии. И, наконец, имеются сообщения о том, что МТ могут защищать клетки трофобласта от индуцированного кадмием апоптоза [17]. Таких данных по МТ в ткани мозга в доступной нам литературе встречено не было, но вполне можно предположить, что одним из защитных механизмов МТ является антиапоптотическое действие. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что Церебролизин индуцирует экспрессию мРНК МТ1 и МТ2, что может обусловливать его нейропротекторное действие.
ЛИТЕРАТУРА
1. Громова О.А. Элементные основы молекулярной фармакологии нейротрофиков природного происхождения. (Микроэлементы как компонент нейропротекторных лигандов) // Сб. научн. статей. Международные экспериментальные и клинические исследования по препарату Церебролизин. — Австрия: издво «Арцмиттел», 2002. — С. 3–7.
2. Громова О.А., Кудрин А.В. Нейрохимия макро и микроэлементов. Новые подходы к фармакотерапии. — М.: Алев В, 2001. — 276 c.
3. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А., Западнюк Б.В. Лабораторные животные. — Киев: Вища школа, 1983. — 276 c.
4. Сотникова Н.Ю., Громова О.А., Новикова Е.А. Нейроиммуномодулирующие свойства Церебролизина // Цитокины и воспаление. — 2004. — Т. 3, № 2. — С. 34–39.
5. Baba H.A., Schmid K.W., Takeda A., et al. Metallothionein: localization in hu0 man transplant endomyocardium, relation to cytokines and allograft function // J. Heart Lung Transplant. — 1999. — Vol. 18, № 10. — P. 963–971.
6. Bauman J.W., Liu J., Liu Y.P., Klaassen C.D. Increase in metallothionein pro0 duced by chemicals that induce oxidative stress // Toxicol. Appl. Pharma0 col. — 1991. — Vol. 110, № 2. — P. 347–354.
7. Bi Y., Palmiter R.D., Wood K.M., Ma Q. Induction of metallothionein 1 by phe0 nolic antioxidants requires metalactivated transcription factor 1 (MTF01) and zinc // Biochem. J. — 2004. — Vol. 380, Pt. 3. — P. 695–703.
8. Cai L., Cherian M.G., Iskander S.et al. Metallothionein induction in human CNS in vitro: neuroprotection from ionizing radiation // J. Radiat. Biol. — 2000. — Vol. 76, № 7. — P. 1009–1017.
9. Chan K.M., Lavidson W., Hew C., Fletcher G. Molecular cloning of metallothionein cDNA and analysis of metallothionein gene expression in winter flounder tissues // Can. J. Zool. — 1989. — Vol. 67. — P. 2520–2527.
10. Dixon T.J., Taggart J.B., George S.G. Application of real time PCR determination to assess interanimal variabilities in CYPIA induction in the European Flounder (Platichthys flesus) // Mar. Environ. Res. — 2002. — Vol. 54. — P. 267–270.
11. Fornace A.J., Schalch H., Alamo I. Coordinate induction of metallothionein I and II in rodents cells by UV0irradiation // Mol. Cell. Biol. — 1988. — Vol. 8, № 11. — P. 4716–4720.
12. Gonzalez M.E., Francis L., Castelleno O. System antioxidant activity of Cerebrolyzin // J. Neural Trasm. — 1998. — Vol. 52. — P. 333–341.
13. Hutter Paier B., Grygar E., Fruhwirth M. et al. Further evidence that Cerebrol0 ysin protects cortical neurons from neurodegeneration in vitro // J. Neural Transm. Suppl. — 1998. — Vol. 53. — P. 363–372.
14. Kagi J.H.R., Schafer A. Biochemistry of metallothionein // Biochemictry. — 1988. — Vol. 27. — P. 8509–8515.
15.Karin M., Haslinger A., Holtgreve R.I. et al. Characterization of DNA sequenc es through which cadmium and glucocorticoid hormones induce human metallothionein IIa gene // Nature. — 1984. — Vol. 308, № 6959. — P. 513–519.
16. Kindermann B., Doring F., Pfaffl M., Daniel H. Identification of genes respon sive to intracellular zinc depletion in the human colon adenocarcinoma cell line HT029 // J. Nutr. — 2004. — Vol. 134, № 1. — P. 57–62.
17. McAleer M.F., Tuan R.S. Metallothionein overexpression in human trophoblas tic cells protect against cadmiuminduced apoptosis // Vir. Mol. Toxicol. — 2001. Vol. 14, № 1. — P. 25–42.
18. Oguro T., Yoshida T. Effect of ultraviolet A on ornithine decarboxylase and metallothionein gene expression in mouse skin // Photodermatol. Photoimmu0 nol. Photomed. — 2001. — Vol. 17. — P. 71–78.
19. Park J.D., Liu Y., Klaassen C.D. Protective effect of metallothionein against the toxicity of cadmium and other metals (1) // Toxicology. — 2001. — Vol. 163, № 2–3. — P. 93–100.
20. Ramakrishnan S., Sulochana K.N., Selvaraj T. et al. Smoking of beedies and cat0 aract: cadmium and vitamin C in the lens and blood // Brit. J. Ophthalmol. — 1995. — Vol. 79. — P. 202–206.
21. Tai S.K., Tan O.J., Chow V.T. et al. Differential expression of metallothionein 1 and 2 isoforms in breast cancer lines with different invasive potential: identification of a novel nonsilent metallothionein 1H mutant variant // Am. J. Pathol. — 2003. — Vol. 163, № 5. — P. 2009–2019.
22. Veinbergs I., Mante M., Mallory M., Masliah E. Neurotrophic effects of Cere0 brolysin in animal models of excitotoxicity // J. Neural Transm. Suppl. — 2000. — Vol. 59. — P. 273–280.
The protective role of cerebrolysininduced metallothionein and metallothioneinII gene expression in cerebral focal ischemia in rats O.A. Gromova1 , N.Yu. Sotnikova1,2 , S.I. Kataev1 , A.N. Galustyan2 , L.M. Krasnich3 , S.V. Mazina1 1 Department of clinical pharmacology, Ivanovo State Medical Academy, Ivanovo; 2 Ivanovo State Research Institute named after V.N. Gorodkov; 3 Institute of clinical pharmacology, Moscow
Cerebrolysin (FPF1070) is known as an agent with neuroprotective, antioxidant and neurotrophic effects. Numerous pharmacodynamic effects of cerebrolysin are caused by presence of lowmolecular fraction of neuropeptides and Lamino acids. There are known clinical benefits of using FPF1070 in patients with brain ischemia but the precise molecular mechanism of protection is not fully understood. Metallothioneins (MTs) are small, cysteinerich, metal binding proteins often considered as stressrelated proteins capable of protecting cells from heavy metal toxicity and oxidative free radicals. In the present study, we investigated whether increased expression of MTs in rats affords protection against mild focal cerebral ischemia. Transient focal ischemia was induced by occluding both common carotid artery and the right middle cerebral artery for 30 min. FPF1070 was administered to an experimental group of animals in a dose of 10 micrograms per gram weight intravenously 1 hour before initiating ischemia. The 8fold and 7.8fold increase of MT1 and MT2 mRNA expression in the cortex of rats with induced ischemia was found by realtime quantitative PCR. In FPF1070 treated rats 16.2 and 16.5fold increase of mRNA expression was seen. These results suggest that protective mechanism of FPF1070 in cerebral ischemia is mediated via upregulation of several protective proteins, including MT. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 1. P. 42–46.)
