Р.С. Будагов, Л.П. Ульянова Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск Влияние ингибитора циклооксигеназы 2 – мелоксикама на течение и исход комбинированного радиационного поражения
Р.С. Будагов, Л.П. Ульянова Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск Влияние ингибитора циклооксигеназы 2 – мелоксикама на течение и исход комбинированного радиационного поражения
Целью работы было изучение эффективности селективного ингибитора циклооксигеназы 2 — мелоксикама (М) как средства предупреждения воспаления и профилактики сепсиса при комбинированных радиационных поражениях (КРП). Эксперименты выполнены на мышах-самцах (СВАС57Bl/6)F1. Животных подвергали общему однократному облучению в дозе 7 Гр и затем наносили термический ожог 10 % поверхности тела. Исследовано влияние М на уровень IL6 и на выраженность некоторых проявлений реакций острой фазы. Установлено повышение концентрации IL6 в сыворотке крови животных в первые 6–24 ч после КРП. Показано, что однократное введение М за 1 ч до КРП не модифицирует накопление IL6 в сыворотке крови, не влияет на показатели степени лейкоцитоза, ранней гиперферментемии (уровня аланинаминотрансферазы) и не повышает содержание альбумина в сыворотке мышей с КРП. Использование ингибитора циклооксигеназы не привело к облегчению клинического течения патологии и улучшению интегрального исхода поражения. Независимо от использованной схемы введения М (за 1 ч до КРП, через 1–3 сут или через 6–8 сут после КРП), все подопытные животные погибали на протяжении первых 15 сут наблюдения. Делается заключение о неэффективности применения М при КРП. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 4. С. 7–10.)
Полимикробный сепсис относят к разряду тяжелейшей патологии—смертность от сепсиса достигает 30–50 %, и цифра эта с годами практически не уменьшается [7]. В условиях комбинированных радиационных поражений (КРП), когда у раненых или у обожженных развиваются нейтропения и эндогенная кишечная инфекция, риск развития сепсиса возрастает, что делает прогноз для выживания пострадавших еще более проблематичным. В последние годы представления о природе сепсиса принципиально изменились—главную роль в этих представлениях стали играть не микробы и бактериальные токсины как таковые, а гипервоспалительная реакция на них со стороны моноцитов/макрофагов [5, 10, 13]. Исходя из такой постановки вопроса, можно утверждать, что и средства ранней (превентивной) терапии сепсиса при КРП должны отбираться из числа препаратов, обладающих способностью регулировать активность макрофагов и обеспечивающих системное подавление провоспалительной активности моноцитов/макрофагов, как минимум, на первые 72 ч после травмы [4, 8, 11]. Весьма заметное место в регуляции макрофагов занимает применение фармакологических средств, ограничивающих эффекты медиаторов воспаления (селективные ингибиторы цитокинов—TNF? и интерлейкинов, лекарственные препараты ингибиторы циклооксигеназы и биосинтеза простагландинов, окиси азота и др.).
Целью настоящей работы было изучение эффективности ингибитора циклооксигеназы—мелоксикама как средства для предупреждения воспаления и профилактики сепсиса при КРП. Мелоксикам (М)—нестероидный противовоспалительный препарат, является селективным ингибитором индуцибельной формы изофермента циклооксигеназы 2, редуцирует синтез простагландинов, демонстрирует обезболивающую и противовоспалительную активность при внутрижелудочном применении. Учитывая характер патологии при КРП и роль бактериальных эндотоксинов в патогенезе КРП [1], важной предпосылкой для оценки эффективности М при КРП являются сведения о том, что M успешно подавляет некоторые воспалительные реакции, наблюдаемые после инъекции бактериального эндотоксина (ЛПС) подопытным животным [6, 9, 12]. Материалы и методы Эксперименты выполнены на мышах-самцах (СВА?С57Bl6)F1 массой тела 22–24 г. Животных подвергали общему однократному облучению в дозе 7 Гр на гамма-установке «ЛУЧ» с источником 60 Со (мощность дозы составляла 0,45 Гр/мин). При моделировании КРП глубокий термический ожог 10 % общей площади поверхности тела наносили с помощью мощной вспышки света. Шесть галлогеновых ламп устанавлива# лись параллельно обжигаемой поверхности кожи, на расстоянии 10 мм от нее. Длительность световой вспышки составляла 2 секунды, термический ожог наносили сразу после облучения. Нами проведено исследование содержания IL6 в сыворотке крови и степени выраженности некоторых других проявлений острофазной реакции (лейкоцитарная реакция, гиперферментемия печеночной аланинаминотрансаминазы (АЛТ), уменьшение концентрации отрицательного белка острой фазы—альбумина) у животных, подвергшихся КРП на фоне предварительного введения М. Для забора материала на каждую точку наблюдения умерщвляли по 5 мышей. Полученные образцы крови оставляли на 2 ч при комнатной температуре для свертывания. Сыворотку крови отделяли центрифугированием, замораживали и хранили вплоть до проведения иммуноферментной реакции. Для определения концентрации IL6 использовали коммерческие наборы реагентов «OPTEIA MOUSE IL6 ELISA KIT» производства фирмы «Pharmingen» (Сан Диего, США). Измерения количества лейкоцитов в периферической кро# ви выполнены на автоматическом гематологическом анализаторе MINOS STX (Франция). Активность АЛТ и концентрацию альбумина в сыворотке крови определяли с помощью стандартных наборов реагентов фирмы Sigma Diagnostics (США). Лечебный препарат М (торговая марка «Мелокс») растворяли в физиологическом растворе хлорида натрия из расчета 10 мг/кг, вводили внутрижелудочно через зонд, в объеме 0,2 мл. При выборе дозы М руководствовались данными литературы. В частности, опубликованы подробные результаты изучения фармакологии М на разных видах животных. Оптимальной дозой для мышей при интрагастральном способе введения препарата принята доза 10 мг/кг [2].
Введение М в опытах по оценке 30 суточной выживаемости осуществляли по трем различным схемам: однократно за 1 ч до КРП (ожидаемая ингибиция циклооксигеназы в период острофазной реакции), трехкратно через 1, 2 и 3 сут после КРП (ожидаемая ингибиция периода пострадиационной асептической эндотоксемии) и трехкратно через 6, 7 и 8 сут после КРП (ожидаемая ингибиция периода бактериальной эндотоксемии с бактериемией) [14, 15]. Полученный цифровой материал обработан с помощью общепринятых методов вариационной статистики. Различия между сравниваемыми группами оценивали с помощью критерия Стьюдента и метода «oneway ANOVA» (пакет программ MicroCal Origin 3.0). Достоверность различий по 30 суточной выживаемости мышей в сравниваемых группах выявляли с помощью критерия Фишера. Значения р < 0,05 рассматривались как статистически значимые. Результаты и обсуждение Как показали собственные результаты наблюдений (табл. 1), уровень IL6 повысился втрое по сравнению с биоконтролем уже через 6 ч после КРП, а через 24 ч превосходил наивысшее значение на калибровочной кривой измерения концентрации IL6 (> 2000 пг/мл). Введение М за 1 ч до КРП не изменило ни характера, ни степени проявлений увеличения продукции и накопления сывороточного IL6 в период реакции острой фазы. Не выявлено существенных модифицирующих эффектов М на неспецифические реакции острой фазы. Как видно из табл. 2, количество лейкоцитов и активность АЛТ повышались практически в равной мере через 6 ч после КРП (контроль) и КРП в условиях предварительного введения М. Назначение противовоспалительного средства за 1 ч до КРП не предотвращало снижение т.н. «отрицательного белка острой фазы» альбумина в сыворотке крови. Через 24 ч после КРП концентрация его составляла 2,55 ± 0,25 г/л и статистически значимо не отличалась от значения контроля (КРП без М, 2,49 ± 0,42 г/дл). На рис. 1 приведены обобщенные данные трех опытов по оценке влияния М на 30 суточную выживаемость мышей с комбинированным радиационно термическим поражением (КРТП). Использование ингибитора циклооксигеназы не привело
Таблица 1 Влияние мелоксикама на изменения концентрации IL6 (пг/мл) в сыворотке крови мышей после КРП
Таблица 2 Влияние мелоксикама на проявления реакции острой фазы (лейкоцитоз, ферментемия и содержание альбумина в сыворотке крови мышей) при КРП
к облегчению клинического течения патологии и улучшению интегрального исхода поражения. Независимо от использованной схемы введения М все подопытные животные погибали на протяжении первых 15 сут наблюдения. Ранее нами были выполнены опыты по оценке влияния антител к провоспалительному цитокину IL6 на выживаемость мышей с КРТП [2]. IL6 относят к интегральным медиаторам из числа цитокинов, выделяющихся во время реакции острой фазы на повреждение. Моноклональные антитела к IL6 [Mouse IL6 MAb (Clone MP520F3), R&D, USA] вводили внутрибрюшинно, из расчета 10 мкг/мышь, в 0,2 мл физиологического раствора в те же сроки, что и М. Применение моноклональных антител для нейтрализации эндогенного IL6 in vivo (рис. 2) способствовало существенному повышению выживаемости животных с КРТП—до 30 х суток выжило по 60 % мышей при назначении антител за 1 ч до КРТП и через 1, 2 и 3 сут после КРТП. Введение антител через 6, 7 и 8 сут после КРТП обеспечило наибольшую выживаемость—90 %, тогда как среди нелеченых мышей с КРТП к исходу второй недели гибель составила 100 % (р < 0,01). Приведенные результаты прямо указывают на важную роль реакции острой фазы и системной воспалительной реакции в патогенезе КРП. В частности, как можно предположить на основании рис. 2, блокада активности IL6 на раннем этапе развития КРТП предотвращает «прайминг» макрофагов и повышение чувствительности к сепсису, что и обусловливает повышение выживаемости животных. Обнаруженная в настоящей работе неэффективность селективного ингибитора циклооксигеназы 2 может свидетельствовать о сравнительно малозначительном участии каскада метаболических превращений арахидоновой кислоты и биосинтеза простагландинов в процессах, имеющих непосредственное отношение к «праймингу» макрофагов в отношении развития сепсиса.
Рис. 1. Влияние мелоксикама на 30 суточную выживаемость мышей с КРП
Мелоксикам вводили в дозе 10 мг/кг, внутрибрюшинно, за 1 ч до КРП, через 1, 2, 3 сут после КРП и через 6, 7, 8 сут после КРП.
Рис. 2. Выживаемость мышей с КРП (1) при введении антител против IL6 за 1 ч до КРП (2), через 1–3 сут (3) и на 6–8 сут после КРП (4)
Авторы выражают благодарность лаборантам исследователям Т.Н. Клячиной, Т.А. Ереминой и С.В. Андреевой за постоянную помощь в проведении экспериментов и первичной обработке материала. О.В. Первишко, Н.В. Колесникова, Л.А. Никулин Кубанская государственная медицинская академия, г. Краснодар Применение препарата Ликопид у новорожденных с задержкой внутриутробного развития на фоне инфекционного процесса При сочетании задержки внутриутробного развития (ЗВУР) с инфекционной патологией выявлены дефекты основных функций нейтрофильных гранулоцитов (НГ) и изменение уровня регулирующих их цитокинов. Применение комплексной терапии приводит к получению клинических эффектов, но иммунологические показатели при этом не достигают уровня здоровых новорожденных. При сочетании комплексной терапии с иммуномодулятором Ликопид наблюдается не толь( ко положительный клинический эффект, но и достоверное улучшение иммунологических показателей. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 3. С. 11–15.)
Влияние патологических факторов в период беременности увеличивает риск нарушений соматического, иммунного и неврологического статуса новорожденных, а также их инфекционную заболеваемость, что определяет выживаемость, а также уровень здоровья ребенка в последующие годы жизни [1]. Система нейтрофильных гранулоцитов (НГ) является первой линией за щиты при инфекционном процессе, поэтому актуально исследование ее роли в наступлении преждевременных родов, при инфекционном процессе, хронической плацентарной недостаточности. Повышенный риск бактериальной инфекции у новорожденных с различными вариантами задержки внутриутробного развития (ЗВУР) связан с относительно высокой частотой внутриутробного и нозокомиального инфицирования и с выраженными нарушениями механизмов антибактериальной защиты организма [3]. Установлено также, что в основе патогенеза рождения новорожденных с ЗВУР лежит продукция нейтрофилами широкого спектра провоспалительных цитокинов [2]. В связи с этим актуальным является изучение системы НГ и регулирующих их активность сывороточных цитокинов, а также выбор адекватной иммунокоррекции. В наибольшей степени к процессу естественной иммунорегуляции приближен синтетический аналог глюкозаминил мурамилдипептида, известный как иммуномодулятор Ликопид [5], успешно применяющийся для лечения и профилактики заболеваний инфекционной этиологии у новорожденных различного гестационного возраста [4, 7]. Целью нашего исследования была оценка функциональной активности нейтрофилов (фагоцитарной, кислородзависимой биоцидности), а также уровня сывороточных цитокинов (IL1?, IL8, GCSF, TNF?) на фоне инфекционного процесса у новорожденных с различными вариантами ЗВУР, с обоснованием целесообразности включения Ликопида в их комплексную терапию. Материалы и методы Обследовано 75 новорожденных с ЗВУР от матерей с отягощенным соматическим и акушерско,гинекологическим анамнезом. Среди них 36 имели гипотрофический вариант (1 я группа), 19 из которых включены в работу по клинико-иммунологической эффективности Ликопида; 28 — гипопластический вариант (2 я группа), у 13 из которых применялся Ликопид; и 11 новорожденных — диспластический вариант (3 я группа), 9 из которых получали Ликопид. Большинство детей при рождении имели признаки асфиксии, о чем свидетельствует оценка по шкале Апгар: у 23 (30,6 %) она составила 3–5 баллов, у 38 (50,7 %) — 5–7 баллов и только у 14 детей (18,6 %) не было признаков асфиксии. Всем детям при рождении проводили антропометрическое измерение основных параметров физического развития (табл. 1). У новорожденных с диспластическим вариантом ЗВУР измененные массоростовые показатели сочетались с врожденными пороками развития (синдром Дауна, пороки сердца, врожденная косолапость, шестипалость) и с много, численными стигмами черепа, лица, конечностей. Течение раннего неонатального периода было отягощено инфекционным процессом с преобладанием врожденной пневмонии, с соответствующей клинической и рентгенологической кар, тиной у новорожденных 2 й (72,1 %) и 3 й группы (84,2 %), в то время как для детей 1 й группы более характерным было наличие инфекций кожных покровов (до 11 %) и врожденного конъюнктивита (до 16 %). В комплексное лечение новорожденных входила антибактериальная терапия цефалоспоринами II–III поколения, аминогликозидами (амикацин, метилмицин), а также инфузионная и симптоматическая терапия, местная обработка глаз и кожных покровов. В основных клинических группах на фоне комплексного лечения иммуномодулятор Ликопид назначался перорально в дозе 0,5 мг 2 раза в сутки за 20–30 минут до кормления в течение 10 дней, а дети контрольных подгрупп получали изолированную комплексную терапию. Группу сравнения составили 34 доношенных новорожденных с физиологическим течением периода адаптации. Функциональную активность НГ оценивали в реакции фагоцитоза бактерий Staphylococcus aureus (штамм 209) с определением степени его завершенности по относительному и абсолютному содержанию активно фагоцитирующих клеток (ФАН %, ФАН абс), фагоцитарному числу и фагоцитарному индексу (ФЧ, ФИ), проценту и индексу переваривания, интегральному показателю переваривающей активности (% П, ИП, ИППА). Кислородзависимую биоцидность НГ оценивали в тесте спонтанного и стимулированного восстановления нитро, синего тетразолия (НСТ,тест) по проценту формазан,позитив, ных клеток (% ФПК спонт, % ФПК стим), среднему цитохимическому индексу (СЦИ спонт, СЦИ стим) и коэффициенту мобилизации (КМ) [6]. Исследование уровня сывороточных цитокинов проводили иммуноферментным методом с использованием тест систем ООО «Цитокин» (Санкт Петербург) с порогом чувствительности 20 пг/мл. Исследования указанных параметров иммунитета проводи, ли дважды: в острый период инфекционного процесса, а также при выписке детей из стационара. Полученные результаты подвергали статистической оценке с помощью t,критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
В сравнении с практически здоровыми новорожденными в острый период инфекционного процесса отмечалось трехкратное увеличение количества лейкоцитов периферической крови и ФАН %. При этом показатели поглощения и переваривания объектов фагоцитоза были достоверно снижены при всех вариантах ЗВУР, но в наибольшей степени (в 2 раза)—во 2 й и 3 й клинических группах (рис. 1). Установлено, что в клинических группах имеет место достоверное снижение % ФПК и уменьшение СЦИ в спонтанном НСТ тесте, максимально выраженное во 2й и 3 й группах. При стимуляции НГ in vitro у всех новорожден ных с ЗВУР отмечалось снижение данных показателей в среднем в 10–14 раз, что выразилось в достоверном уменьшении величины КМ. Столь выраженное ослабление функций НГ может служить одной из причин выявленных нарушений завершенности фагоцитарного акта у ново рожденных при различных вариантах ЗВУР(табл. 2). При определении цитокинов крови в острый период выявлено резкое увеличение содержания IL8 во всех клинических группах при сохранении IL1?, TNF?, GCSF на уровне контроля (рис. 2).
Таблица 1 Массо-ростовые показатели исследуемых групп
Примечание. * — Отличие от контроля достоверно при p < 0,05.
Рис. 1. Показатели фагоцитарной активности НГ в острый период инфекционного процесса
Таблица 2 Влияние препарата Ликопид на оксидазную микробицидную активность НГ у новорожденных с различными вариантами ЗВУР (М ± m)
Примечание. Достоверные отличия от контроля: *** — p < 0,001, ** — p < 0,05, * — p < 0,01.
Рис. 2. Уровень сывороточных цитокинов на 1 е–3 и сутки (% от контроля)
Включение в комплексную терапию Ликопида позволило получить выраженные положительные клинические эффекты в виде сокращения курсов антибактериальной терапии в среднем на 33 %, уменьшения длительности воспалительного процесса в легочной ткани (рис. 4), более ранней отмены инфузионной терапии, стабильной прибавки массы тела в результате раннего прикладывания к груди (рис. 5), снижения длительности пребывания новорожденных в условиях стационара (в среднем на 21 %). Проведение изолированной комплексной терапии (без включения Ликопида) у новорожденных с различными вариантами ЗВУР не позволило полностью устранить дисфункции в системе НГ и нормализовать уровень сывороточных цитокинов, тогда как результаты сочетанной с Ликопидом терапии показали позитивные иммуномодулирующие эффекты Ликопида, заключающиеся в полном восстановлении функциональной активности НГ к моменту выписки детей (см. рис. 3, рис. 6).
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о высокой клинико иммунологической эффективности Ликопида при инфекционных осложнениях различных вариантов ЗВУР новорожденных.
Рис. 3. Показатели фагоцитарной активности при выписке на фоне комплексной терапии и сочетанной терапии с Ликопидом
Рис. 4. Клиническая эффективность комплексной терапии и сочетанной терапии с Ликопидом
Рис. 5. Влияние комплексной и сочетанной терапии с Ликопидом на клинические эффекты
Рис. 6. Уровни цитокинов при выписке на фоне комплексной терапии и сочетанной терапии с Ликопидом (в % к контролю)
ЛИТЕРАТУРА
1. Андреева Г.В., Черданцева Г.А., Чистякова Г.Н. Роль патологии беременности и родов в формировании иммунологической дизадаптации у доношенных новорожденных // Мед. иммунология. — 2004. — Т. 6, № 3–5. — С. 372–373.
2. Володин Н.Н., Дегтярева М.В. Иммунология перинатального периода: проблема и перспективы // Педиатрия. — 2001. — № 4. — С. 4–6.
3. Дегтярева М.В., Володин Н.Н., Бахтикян К.К. и др. Особенности продукции цитокинов, субпопуляционного состава лимфоцитов и функционального со, стояния нейтрофилов при неонатальных пневмониях и способы иммунокоррекции // Мед. иммунология. — 2000. — Т. 2, № 1. — С. 69–76.
4. Несмеянов В.А. Глюкозаминилмурамоилпептиды: на пути к пониманию молекулярного механизма биологической активности // Int. J. Immunorehabilit. — 1998. — № 10. — P. 19–29.
5. Таболин В.А., Володин Н.Н., Дегтярева М.В. и др. Актуальные вопросы перинатальной иммунологии // Int. J. Immunorehabilit. — 1997. — № 5. — Р. 112–122.
6. Кулагина М.Г. Иммунопрофилактика и иммунокоррекция Ликопидом инфекционно,воспалительных осложнений у новорожденных с респираторным дистресс,синдромом. — Автореферат дисс. .. . канд. мед. наук. — 2004.
7. Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А. Комплексное трехуров, невое исследование системы нейтрофильных гранулоцитов с возможной диагностикой ИДС при различной патологии // Методич. рекоменд. — № 96/11. — МЗ РФ, 1996. — 24 с.
Application of Licopid in newborns with intrauterine growth retardation against the background of infectious process O.V. Pervishko, N.V. Kolesnikova, L.A. Nikulin Kuban State Medical Academy, Krasnodar
Intrauterine growth retardation due to infectious pathology is associated with impairment of the major functions of neutrophil granulocytes and profound changes in the levels of cytokines regulating these cells. The application of complex therapy may be clinically beneficial, but does not bring immunologic parameters to the normal levels. The combination of complex therapy with the immune modulator Licopid not only has beneficial clinical effect but improves immunologic status of newborns as well. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 4. P. 11–16.)
