Л.В. Кузякина , Е.С. Снарская , А.Е. Дорофеев , И.И. Ананьева , Б.В. Пинегин , С.Ю. Алентьева , Н.В. Гнучев , С.В. Сучков , А.В. Косталевская , Д.Д. Петрунин МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского; ММА им. И.М. Сеченова; Медицинский центр «Медстайл"Эффект»; Отделение онкологии Павлово"Посадской ЦРБ Московской области; ГНЦ «Институт иммунологии» Росcздрава РФ; Институт биологии гена РАН, Москва; РГМУ, Москва Особенности цитокинового спектра крови у больных с базалиомами кожи: патогенетические и клинические аспекты
При базально клеточном раке (БКР) встречаются три иммунологических фенотипа:
1) синдром опухолеассоциированного вторичного иммунодефицита с выраженными признаками иммуносупрессии;
2) синдром опухоле ассоциированного вторичного иммунодефицита с умеренными при знаками иммуносупрессии;
3) синдром опухолеассоциированного вторичного иммунодефицита с аутоиммунными нарушениями. У 82 больных (63 с БКР и 19 с метатипическим раком кожи) с разными иммунологическими фенотипами изучали уровни сывороточных интерлейкинов, TNF? , TGF? 2, адгезинов, кадхеринов, хемокинов и интерферонов, а также цитокинов Th1 и Th2 лимфоцитов (всего 31 показатель). Дан анализ возможной патогенетической и клинической роли отдельных сывороточных цитокинов, осуществляющих в организме больного функции врожденного и адаптивного звена противоопухолевого иммунитета, в формировании иммунопатологической картины при различных формах заболевания. Данные могут быть использованы при разработке патогенетически обоснованных алгоритмов дифференциальной диагностики, прогноза и лечения различных вариантов БКР. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 3. С. 21–26.)
На рост эпителиальных образований кожи, в частности базальноклеточного рака (БКР) и его отдельных клинических форм, выраженное супрессивное влияние оказывает иммунная система, осуществляющая функции надзора за опухолевым ростом [6]. При прогрессировании эпителиальных новообразований кожи дерматоонколог неизбежно сталкивается с феноменом опухолезависимой иммуносупрессии, создающей препятствия для эффективной иммунотерапии и ограничивающей лечащего врача в выборе эффективных лечебных средств. Данный феномен имеет плейотропную природу, но в большинстве случаев обусловлен секрецией клетками опухоли цитокинов с иммуносупрессивными свойствами, что имеет место в случае ассоциированного с опухолью вторичного иммунодефицита [10]. Цитокины играют особую роль в канцерогенезе, не только контролируя сложнейшие механизмы наследственного и адаптивного звеньев противоопухолевого иммунитета, но и взаимодействуя с клетками самой опухоли, обеспечивая при этом конкретные сценарии развития злокачественных новообразований, в том числе базалиом кожи [13, 14]. В этой связи изучение цитокинового спектра периферической крови становится одним из стратегических направлений в разработке современных технологий иммунотерапии базалиом.
Целью нашего исследования являлось сравнительное изучение содержания наиболее значимых в патогенетическом отношении семейств цитокинов в периферическом кровотоке у больных с метатипическим раком кожи и с различными вариантами течения БКР с последующей оценкой клинической ценности вышеуказанных параметров для практики врачаонколога.
Материалы и методы
Кровь больных с различными клиническими формами БКР и клинически здоровых доноров была получены из МОНИКИ, ММА им. И.М. Сеченова, отделения онкологии Павлово Посадской ЦРБ Московской области и медицинского центра «Медстайл Эффект». Для исследования были взяты образцы крови 130 человек, 48 из них были клинически здоровые доноры и 82—пациенты, из которых у 63 был диагностирован базальноклеточный рак (язвеннонодулярная форма), а у 19—метатипический рак кожи. Среди больных было 57 мужчин и 73 женщины, возраст больных варьировал от 56 лет до 81 года. Специальному лечению (оперативному или консервативному) ни один из пациентов до окончания обследования не подвергался. Часть пациентов получали лишь наружную терапию (обработка растворами антисептиков при значительных размерах язвенных дефектов). Все больные были изначально распределены на три клинические группы с гистологически подтвержденными диагнозами БКР или МТР, а именно: 1я группа (n = 30): не рецидивирующие язвенные формы БКР с Т1N0М0 (диаметр опухоли до 2 см, 1–2 степени изъязвления); 2я группа (n = 36): рецидивирующие формы БКР с дли" тельным течением (более 1 года) с характеристикой Т23N0М0 (диаметр опухоли более 2 см, 2–3 степень изъязвления) (n = 17) и МТР с характеристикой Т1N0М0 (n = 2); 3 я группа (n = 16): больные МТР с характеристикой Т23 N0М0 и 2–3 степенью изъязвления. Распределение пациентов по группам (помимо клинико морфологических особенностей) было обусловлено предварительно полученными данными о нарушении иммунитета по типу синдрома опухолезависимого вторичного иммунодефицита (СОВИД) различной степени выраженности у первых 2 групп пациентов и синдрома опухолезависимого вторичного иммунодефицита с аутоиммунными нарушениями (СОВИДАН) у пациентов третьей группы [2]. Характеристика пациентов по основным критериальным признакам отражена в табл. 1. Цитокиновый спектр крови оценивали по результатам определения концентрации в периферической крови IL1?, IL2, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL12, IL13, IL15, IL18 и IL21,
Таблица 1 Критериальные признаки больных с различными формами базалиом
IFN? и IFN?, эндогенных факторов TNF? и TGF?2, растворимых форм адгезионных молекул ICAM1, VCAM1, L и P селектинов, E и N кадхеринов, а также хемокинов CCL2 (MCP1— хемоаттрактивный белок моноцитов 1), RANTES и IL8 с помощью иммуноферментного анализа. Для этих целей применялись коммерческие наборы реагентов отечественного (НПО «Протеиновый контур», Санкт Петербург) и зарубежного (Innogenetics, Belgium; Research & Diagnostic Systems, England; Biomar Diagnostics Systems, Germany; Promega, USA, и др.) производства. Содержание и активность Th1 и Th2 клеток в периферической крови анализировали путем оценки продукции внутриклеточных цитокинов (IL2 и IFN? в случае Th1 клеток и IL4 в случае Th2 клеток) в CD4+лимфоцитах с использованием проточной цитометрии с помощью прибора FACS Calibur TM 3 CS фирмы Beckton Dickinson (Belgium) [8]. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием t критерия Стьюдента. Результаты и обсуждение Соотношение пропорций циркулирующих в крови представителей многочисленного семейства цитокинов имеет не только патогенетический смысл, но и становится важным клиническим критерием для оценки врачом характера течения заболевания. Результаты исследования содержания цитокинов в периферической крови у пациентов обследуемых групп представлены в таблице 2. Особенности цитокинового профиля больных базалиомами Содержание интерлейкинов в сыворотках крови. При СОВИД I тенденцию к снижению проявляли IL1?, IL7, IL9, IL12 и IL21, при этом максимально низкие значения зарегистрированы для IL1? и IL12. Наоборот, тенденция к росту была замечена у IL4, IL5, IL6 и IL10. Самые высокие значения сывороточных концентраций отмечены у IL4 и IL10 (см. табл. 2). В случаях СОВИДАН тенденцию к снижению, как и в случае СОВИД, демонстрировали IL7, IL9 и IL21, однако здесь минимальные значения зафиксированы для IL9 и IL21. Концентрация IL13 оказалась в 4 раза меньше чем у здоровых доноров. Что касается концентраций IL1? и IL12, то в данном случае они оказались повышенными, причем для IL1? весьма значительно. Значительное повышение концентрации отмечено для IL5, IL6, IL8 (более выраженное, чем при СОВИД I). Содержание IL10 также оказалось повышено, но не столь значительно, как при СОВИД I. Повышения уровня IL4 в случае СОВИДАН не наблюдалось. Ни в случаях СОВИД, ни в случае СОВИДАН не обнаружено видимых сдвигов в сывороточных концентрациях IL2 и IL15.
Таблица 2 Характеристика цитокинового спектра крови у больных с различными вариантами течения базалиом
Примечание . Различия между показателями больных и здоровых доноров статистически достоверны: * — p < 0,001; ** — p < 0,05; *** — p < 0,01.
IL18 проявил выраженный рост и при СОВИД I и при СОВИДАН. Содержание TNF? и TGF? 2 в периферическом кровотоке. Для СОВИД I характерным оказалось снижение концентрации TNF? и TGF?2 (см. табл. 2). В случае СОВИДАН лишь TGF?2 демонстрировал тенденцию к понижению, в то время как для TNF? характерным оказалось значительное повышение концентрации. Сывороточные концентрации VEGF 1 в случае обоих синдромов (СОВИД I и СОВИДАН) были увеличены. Содержание адгезионных молекул (адгезинов) в периферической крови. В группе с фенотипом СОВИД I имелась тенденция к снижению содержание в сыворотках крови E селектина, E кадхерина и VCAM1 (см. табл. 2). Концентрация sICAM1 существенно не изменялась. В группе больных с СОВИДАН концентрация указанных адгезинов, включая sICAM1, ощутимо уменьшалась. Концентрации N кадхерина в случаях СОВИД I и СОВИДАН оказались повышенными, причем в последнем случае более чем в 2 раза. Содержание хемокинов в сыворотках крови. У больных с СОВИД I значения сывороточных концентраций хемокинов RANTES и IL8 превышали норму, тогда как MCP1 сохранялся в границах физиологических колебаний (см. табл. 2). При СОВИДАН интенсивность роста сывороточных титров RANTES и IL8 также существенно увеличивалась, причем более выражено, чем при СОВИД I (последний—почти в 2 раза сильнее). MCP 1 же проявлял тенденцию к резкому падению своей концентрации. Содержание интерферонов в периферическом кровотоке. Как при СОВИД I, так и при СОВИДАН было выявлено понижение концентрации INF? и INF?. Но более выраженный характер оно носило при СОВИДАН (для INF? продемонстрировано снижение содержания в сыворотке более чем в 2 раза) (см. табл. 2). Для больных с иммунологическим вариантом заболевания СОВИД II какихлибо заметных отклонений от значений нормы для тестируемых выше показателей цитокинового спектра крови не обнаружено (см. табл. 2). Содержание субпопуляций Th17 и Th27клеток в крови больных с базалиомами И у больных с СОВИД (преимущественно с иммунофенотипом I), и у больных с СОВИДАН обнаружено снижение индекса Th1/Th2, отражающее долевое соотношение в периферическом кровотоке двух особых субпопуляций клеток-хелперов с иммунорегуляторными свойствами (Th1 и Th2 лимфоцитов) (см. табл. 2). Основной вклад в снижение данного индекса вносит сокращение размеров субпопуляции Th1 лимфоцитов, характерное и для СОВИД, и для СОВИДАН. В случае СОВИДАН, однако, наблюдаемое сокращение провоцируется не только снижением доли Th1 клеток, но и возрастанием иммунорегуляторных клеток с фенотипом Th2 лимфоцитов. Особенности цитокиновой архитектоники периферической крови и их клинико7патогенетическая значимость у больных с различными вариантами течения базалиом Существует два класса Т хелперов, секретирующих Тh1 и Тh2 зависимые интерлейкины. Вырабатываемые Th1 лимфоцитами IL12 и IFN?, атакже TNF?, определяют специфику клеточноопосредованного иммунного ответа, являясь при этом факторами роста, индукторами цитотоксических лимфоцитов (в том числе NK клеток), индукторами макрофагов. Цитокины. Th1 играют значительную роль в супресии опухолевого роста. Отмечено, например, что рост концентрации Th1 клеток в очаге опухолевой инфильтрации способствует подавлению интенсивности прогрессирования, а в ряде случаев спонтанной регрессии базалиом [14]. IL12 широко используется сегодня для противоопухолевой терапии, в том числе в комплексном лечении БКР [12]. При СОВИД I, как показано, существенное уменьшение в кровотоке доли Th1клеток сочетается с заметным подавлением секреции IL12 и IFN?. Более того, наблюдаемая отрицательная динамика отражает, как нами установлено, новый феномен—феномен ассоциативности между гипофункцией оси IL12/IFN? и падением доли Th1 клеток, с одной стороны, и выявленным нами ранее у больных с СОВИД I угнетением функции цитотоксичности, с другой [1]. Установлена также зависимость между сывороточной концентрацией IL1?, влияющего на индукцию Th1 или Th2 ответа и низким содержанием циркулирующего в крови пула дендритных клеток (ДК), без которых Т клеточная активация и Т клеточный ответ невозможны [1]. Об этом также свидетельствуют данные ряда авторов, отметивших недостаточность функции ДК в обеспечении противоопухолевого иммунитета в связи с низким содержанием в ткани опухоли и околоопухолевом инфильтрате IL1? [9]. При смене у больных с СОВИД фенотипа 1 на фенотип II (уменьшение степени изъязвления и размеров опухоли) опухоль утрачивает свой инвазивный потенциал и лишается выраженных агрессивных свойств. При этом показатели Th1 возвращаются к нормальным величинам, пациенты с БКР приобретают значительный ресурс цитотоксичности. Иная картина наблюдается при смене фенотипа СОВИД на СОВИДАН. Морфологически смена фенотипов характеризуется появлением пула плоскоклеточных структур и в дальнейшем увеличением их удельного количества. Клинически смена иммунологических фенотипов характеризуется следующими признаками: увеличением размеров опухолевого очага (свыше Т2), увеличением степени инвазии и глубины опухолевого дефекта (свыше II степени), образованием подрытых и обрывистых краев опухоли; формированием на поверхности толстой и грубой корки, появлением кровоточивости, образованием плотного инфильтрата и эритемы по периферии язвенного дефекта, появлением зуда и боли в области опухоли [3]. Иммунологически на фоне роста доли Th2 клеток отмечается тенденция к увеличению Th2 зависимых IL5 и IL10 (а также IL4 и IL6), фокусирующих свое действие на В звене иммунитета, активируя пролиферацию и синтез В клетками антител (в том числе противоопухолевых) [13]. На факт резкой активации секреции IL5 трансформированными и опухолевыми клетками указывают T. Lalani et al., имеющие основания полагать, что совокупное увеличение в крови вышеуказанных цитоки нов на фоне усиления агрессивных свойств базалиом связано не только с продукцией цитокинов иммуноцитами, но и с началом продукции IL4, IL5 и IL10 клетками самой опухоли [11]. Сывороточная концентрация IL6 также увеличивается в несколько раз при смене фенотипов СОВИД на СОВИДАН. Как известно, IL6 активно способствует формированию канцерогенного потенциала базалиом, подавляя апоптоз опухолевых клеток и одновременно стимулируя процессы ангиогенеза; увеличение содержания IL6 в тканях опухоли и крови рассматривается авторами как прогностически неблагоприятный признак [7]. Концентрации же IL13, относящегося к цитокинам с выраженными противоопухолевыми свойствами, IL7 и IL9, продуцируемых кератиноцитами, клетками базалиомы и рядом других клеток микроокружения опухоли, важных для дифференцировки и активации как цитотоксических клеток, так и пре В лимфоцитов, позитивно влияющих и на Th2 ответ и противоопухолевый иммунитет в целом, при СОВИДАН значительно снижены. Таким образом, дисбаланс в составе Th1/Th2 субпопуляций, имеющий корни во вторичных дефектах цитокинового спектра (в первую очередь, тандемов IL12/IFN? и IL5/IL10), а также концентрации ряда других интерлейкинов, указанных выше, должен учитываться в едином пакете критериальных маркеров при мониторинге больных с базалиомами, в том числе на фоне иммунотерапии. Важную патогенетическую и клиническую значимость имеют и другие интерлейкины. Содержание большинства адгезионных молекул (адгезинов и селектинов) у больных с базалиомами, независимо от клинической формы и фенотипа, заметно снижено, что свидетельствует о недостаточности ресурса в составе адгезинового пула для сохранения стабильности стромальной архитектоники в ходе развития базалиом. Более определенные доказательства в пользу этого довода получены при анализе профиля кадхеринов. При прогрессии базалиом и смене фенотипа с СОВИД на СОВИДАН уровень сывороточного E кадхерина, входящего в семейство мощных супрессоров прогрессии базалиом, заметно уменьшается, а N кадхерина, участвующего в миграции опухолевых клеток на большие расстояния (метастазировании) за счет взаимодействия со стромой и эндотелием, увеличивается. При определенных условиях на этапе малигнизации происходит замена/переключение синтеза с E кадхерина на N кадхерин, что в перспективе будет иметь существенное значение для разработки дополнительных иммунологических критериев течения эпителиальных новообразований кожи [5]. Уровни хемокинов IL8 и RANTES, задействованных в стимуляции процессов ангиогенеза и лимфоцитарной инфильтрации опухолевого очага тучными клетками, и ангиогенного фактора VEGF 1, определяющего состояние проницаемости сосудов и участвующего в метастазировании, также повышались соответственно усилению агрессивных свойств опухоли, а показатели TGF?2, активно участвующего в контроле дифференцировки и роста кератиноцитов и принадлежащего к иммуносупрессивным цитокинам, и MCP1, являющегося аттрактантом для моноцитов и активированных Т клеток,—снижались. Заключение Дефекты продукции различных цитокинов характерны для канцерогенеза, демонстрируя различную динамику при прогрессии опухолевого роста, в том числе новообразований кожи.
Столь выраженная неоднородность в характере дефектов связана с тем, что способностью взаимодействовать с цитокинами обладают не только клетки, обеспечивающие поддержание иммунологического гомеостаза (лимфоциты и др.), но и клетки самой опухоли [13]. Вот почему при онкопроцессе цитокины необходимо рассматривать в качестве составных частей двух взаимодействующих друг с другом систем:
1) иммунокомпетентные клетки — цитокины;
2) опухолевые клетки — цитокины.
Как правило, в условиях интенсивного опухолевого роста доминирует вторая система, полностью нивелируя противоопухолевый ресурс Т клеточных цитокинов [10, 13]. Именно в этом состоит уникальность и заметный негативизм реализации плейотропных эффектов цитокинов при злокачественном росте, и именно в этой связи естественный (наследственный) противоопухолевый иммунитет, будучи слабым, может легко преодолеваться при участии иммуносупрессивных механизмов, к числу которых принадлежат опухолеассоциированные цитокины с иммуносупрессивными свойствами [10]. Механизмы же специфического (адаптивного) противоопухолевого иммунитета с участием, в частности, Т клеточных цитокинов начинают проявляться лишь при заметном накоплении массы опухоли. Они вносят в контроль за опухолевой массой существенный вклад, но предотвраить рост опухоли уже не могут, поскольку основной механизм защиты от опухолевого роста не гуморальный, а клеточный. Помимо патогенетической значимости цитокинов в развитии эпителиальных новообразований, нами продемонстрирована и клиническая ценность определения в соответствующих сочетаниях сывороточных цитокинов, осуществляющих в организме больного функции как наследственного, так и адаптивного звена противоопухолевого иммунитета. По мнению F. Bellardelli, M. Ferrantini, именно репертуар цитокинов является фактором, определяющим характер взаимодействия опухоли со своим микроокружением и системой противоопухолевого иммунитета [4]. Вместе с тем, в условиях активного роста опухоли цитокиновый ресурс во многом остается нереализованным [10]. Опухолевая прогрессия может сопровождаться развитием нарушений на любом из перечисленных выше уровней. Цитокиновая дисрегуляция включает: изменение секреции цитокинов традиционными клетками продуцентами под влиянием роста опухоли; появление ингибиторов продукции цитокинов; появление растворимых форм цитокиновых рецепторов, большинство из которых—ингибиторы функций иммунокомпетентных клеток. Изучение столь тонких молекулярных инструментов, как цитокины, обеспечивающие кооперативное взаимодействие между адаптивным и наследственным звеньями иммунитета, становится одним из стратегических направлений при создании современных средств и технологий иммуногенодиагностики и иммунотерапии злокачественных новообразований, в том числе базалиом кожи.
ЛИТЕРАТУРА
1. Снарская Е.С., Дорофеев А.Е., Сучков С.В. и др. Патогенетическая и клиническая значимость особенностей наследственного и адаптивного иммунитета у больных базально клеточным раком кожи // Росс. ж. кожн. венерич. болезней. — 2005. — № 3. — С. 8–15.
2. Снарская Е.С., Зубова Ю.Е., Пронина О.Л. и др. Особенности иммунологической реактивности у больных с язвенно нодулярным типом базально клеточного и метатипического рака кожи // Физиол. патол. иммунной системы. — 2003. — Т. 5, № 2. — С. 227.
3. Снарская Е.С. Иммунологические аспекты патогенеза, дифференциальной диагностики и иммунотерапия язвенной разновидности базальноклеточного и метатипического рака кожи. — Дисс. … дра мед. наук. — Москва, 2005.
4. Belardelli F., Ferrantini M. Cytokines as a link between innate and adaptive antitumor immunity // Trends Immunol. — 2002. — Vol. 23, № 4. — Р. 201–208.
5. Cavallaro U., Schaffhauser B., Christofori G. Cadherins and the tumour progression: is it all in a switch? // Cancer Lett. — 2002. — Vol. 176, № 2. — P. 123–128.
6. Dicker T., Siller G., Saunders N. Molecular and cellular biology of basal cell carcinoma // Australas. J. Dermatol. — 2002. — Vol. 43, № 4. — P. 241–246.
7. Heinrich P.C., Behrmann I., Haan S. et al. Principles of interleukin (IL6 type cytokine signalling and its regulation // Biochem. J. — 2003. — Vol. 374, Pt. 1. — P. 1–20.
8. Hempel G., Galle P.R., Lohr H.F. Quantitative analysis of specific Th1/Th2 helper cell responses and IgG subtype antibodies in interferon"alpha"treated patients with chronic hepatitis C // J. Med. Virol. — 2001. — Vol. 64, № 3. — P. 340–349.
10. Kupper T.S., Fuhlbrigge R.C. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences // Nat. Rev. Immunol. — 2004. — Vol. 4, № 3. — P. 211–222.
11. Lalani T., Simmons R.K., Ahmed A.R. Biology of IL5 in health and disease // Ann. Allergy Asthma Immunol. — 1999. — Vol. 82, № 4. — P. 317–332; 332–333.
12. Trinchieri G. Function and clinical use of interleukin 12 // Curr. Opin. Hema" tol. — 1997. — Vol. 4, № 1. — P. 59–66.
13. Wilson J., Balkwill F. The role of cytokines in the epithelial cancer microenvironment // Semin. Cancer Biol. — 2002. — Vol. 12, № 2. — P. 113–120.
14.Wong D.A., Bishop G.A., Lowes M.A. et al. Cytokine profiles in spontaneously regressing basal cell carcinomas // Br. J. Dermatol. — 2000. — Vol. 143, № 1. — P. 91–98.
Blood cytokine patterns in patients with basalcell carcinoma: pathogenetic and clinical aspects L.V. Kuziakina3 , E.S. Snarskaia1,2 , A.E. Dorofeev4 , I.I. Ananyeva2 , B.V. Pinegin5 , S.Y. Alentyeva2 , N.V. Gnuchev6 , S.V. Suchkov1,2 , A.V. Kostalevskaya7 , D.D. Petrunin7 1 M.F. Vladimirsky Moscow Region Research Clinical Institute; 2 I.M. Sechenov Moscow Medical Academy; 3 «Medstyle Effect» Medical Center; 4 Pavlov Posad Central Regional Hospital, Moscow Region; 5 National Research Center Institute of Immunology, Ministry of Public Health; 6 Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow; 7 Russian State Medical University, Moscow Patients with a basalcell carcinoma (BCC) display three basic immunological phenotypes: (1) tumorassociated secondary immunodeficiency with marked immunosuppression; (2) tumorassociated secondary immunodeficiency with moderate immunosuppression; (3) tumorassociated autoimmune syndrome.
The group of 82 patients (63 with BCC, and 19 with metatypical cancer of skin) with various immunological phenotypes were studied. Serum levels of interleukins, TNF? , TGF? 2, adhesins, cadherins, chemokines and interferones, as well as Th1 and Th2 lymphocyte cytokine patterns (a total of 31 parameters) were analyzed. Pathogenetical and clinical value of individual cytokines for innate and adaptive antitumour immunity is discussed. Potential roles for cytokines in immunopathological changes of various disease forms are considered. The data can be used in development of pathogenetic algorithms of dif ferential diagnosis, prognosis and treatment options for BCC variants. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 3. P. 21–26.)
Key words: basalcell carcinoma, metatypical cancer of skin, cytokines, innate and adaptive immunity.
