Исследование противовоспалительных свойств глипролинов на экспериментальной модели острого перитонита у крыс З.В. Бакаева, Г.Е. Самонина, Б.А. Умарова, Г.Н. Копылова, Е.Л. Гончарова, К.Е. Багликова МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва
Ранее было показано, что глипролины — Pro-Gly-Pro (PGP), Pro-Gly (PG) и Gly-Pro (GP) — уменьшают образование и ускоряют заживление язв, вызванных аппликацией ледяной уксусной кислоты на слизистую оболочку желудка крыс. Учитывая, что ульцерогенез язвообразования включает в себя сильный воспалительный процесс, целью настоящей работы было исследовать противовоспалительные свойства этих пептидов на экспериментальной модели воспаления у животных. Острый перитонит вызывали у самцов белых беспородных крыс внутрибрюшинным введением 1%-го раствора уксусной кислоты, что сопровождалось экссудативной реакцией, выходом активных клеток крови в экссудат с преобладанием нейтрофильного компонента. Биохимический анализ крови показал изменение соотношения белковых фракций крови, характерное для воспаления. Предварительное внутрибрюшинное введение PGP, PG и GP в дозе 3,7 мкмоль/кг приводило к снижению в экссудате относительного количества нейтрофилов по сравнению с контролем и увеличению содержания эозинофилов и плазмоцитов. При этом уровень а1- и а2-глобулинов приближался к норме. Полученные результаты свидетельствуют о противовоспалительном действии PGP, PG и GP при экспериментальном перитоните, что может служить одним из механизмов противоязвенного эффекта глипролинов. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 2. С. 28-32.)
Короткие глицин- и пролинсодержащие пептиды — глипролины — известны своей высокой противоязвенной активностью [1, 15], которая зависит от последовательности аминокислот в молекуле и этиологии язвообразования [3]. Показано, что представители этого семейства, такие как трипептид Рго^1у-Рго и его дипептидные метаболиты Рго^1у и G1y-Pro уменьшают развитие и значительно ускоряют заживление ацетатной язвы [2]. Аппликация ледяной уксусной кислоты на серозную оболочку желудка по методу Окабе (1971) вызывает в месте повреждения разрушение тучных клеток [11], увеличение желатиназной активности [13], интенсивное перекисное окисление липидов и лизис клеточных мембран [8]. Эти процессы протекают на фоне нарушенного локального кровоснабжения, дефицита местных вазодилятаторов [14], что в совокупности приводит к формированию ацетатной язвы с глубоким гнойно-некротическим кратером в центре, часто с прободением. По статистическим данным у людей около 10 % язв желудка и двенадцатиперстной кишки осложняется перфорацией. Последнее сопровождается развитием перитонита и экссудативной реакцией. Экссудат, или выпот — жидкость, пропотевающая из мелких кровеносных сосудов, — содержит белок, лейкоциты, эритроциты, минеральные вещества, разрушенные клеточные элементы, часто микробы. Выпот образуется при любом воспалении, пропитывает окружающие ткани или скапливается в полостях тела, сдавливая окружающие органы и ткани, нарушая их функции. При прорыве из очага воспаления в ткани выпот способствует распространению инфекции. При рассасывании экссудата из брюшной полости остающийся на поверхности серозных оболочек фибрин образует сращения (спайки). Надо отметить, что в наших предыдущих экспериментах у животных, получавших глипролиновые пептиды (ГП), в отличие от контроля, практически не наблюдалось прободений и спаек желудка с соседними органами [2].
Для глипролинов был показан широкий спектр влияний на различные параметры гомеостаза слизистой оболочки желудка (СОЖ) [1, 7], чем, вероятно, и обусловлен их высокий противоязвенный эффект. Особенно интересно, что ГП способны поддерживать адекватные условия микроциркуляции [4],предотвращать увеличение секреторной активности тучных клеток, тем самым ограничивая выброс провоспалительных факторов [9]. Известно, что вещества, уменьшающие воспаление в зоне язвенных дефектов, защищают СОЖ от острых повреждений и ускоряют заживление язв [12]. Предварительное введение Pro-Gly-Pro (PGP), Pro-Gly (PG) и Gly-Pro (GP) уменьшает экссудативную реакцию у крыс, вызванную внутрибрюшинным введением 40 %-ного раствора тиогликолата [10].
Мы провели гистоморфологическое исследование особенностей ускорения заживления ацетатной язвы глипролинами. Все исследуемые пептиды, по сравнению с контролем, в большей или меньшей степени снижают количество нейтрофилов, макрофагов и значительно увеличивают количество фибробластов в зоне язвенного дефекта, что характеризует снижение воспалительного процесса и повышение синтеза коллагена и других компонентов внеклеточного матрикса (неопубликованные данные). Полученные нами и данные литературных источников указывают на возможность проявления у глипролинов противовоспалительных свойств.
Целью настоящей работы было исследование противовоспалительного действия пептидов PGP, PG и GP на экспериментальной модели воспаления — остром перитоните у животных.
Материалы и методы
Учитывая, что воспалительный процесс вызывает изменение проницаемости сосудов, клеточного и белкового состава крови, мы изучили влияние пептидов на экссудативную реакцию путем оценки степени (силы) экссудации, провели микроскопическое исследование брюшного экссудата и определили соотношение белковых фракций крови интактных животных и животных с перитонитом.
Острый перитонит вызывали у крыс массой 160-210 г (после 18-часового голодания) внутрибрюшинным введением 1%-ного раствора уксусной кислоты (1 мл/100 г массы тела). Исследуемые препараты PGP, PG и GP, синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН, в дозе 3,7 мкмоль/кг и физиологический раствор вводили за 1 ч до введения раствора уксусной кислоты. Через 3 ч после введения уксусной кислоты у животных брали кровь из яремной вены для проведения биохимических исследований. Белковые фракции сыворотки крови определяли турбидиметрическим методом [5]. Принцип метода основан на том, что фосфатные растворы определенной концентрации осаждают с образованием очень мелкой взвеси различные белковые фракции сыворотки крови. По степени мутности растворов (устанавливаемой с помощью фотоэлектроколориметра) судят о концентрации белков в исследуемом материале. Затем животных усыпляли эфиром, вскрывали брюшную полость, собирали экссудат, замеряли его объем (в мл). В экссудат добавляли лимоннокислый натрий из расчета 1 г/л выпотной жидкости, чтобы предотвратить свертывание и захват в сгусток клеточных элементов [5]. Экссудат центрифугировали (центрифуга «Jonan», 3500 об/мин), из осадка готовили мазки, красили и сушили на аппарате Hema-Tec 2000 (Bayer, Germany).
Окрашенные препараты просматривали на микроскопе (Zeiss AxioLab, объектив х 100, окуляр х 10) с иммерсионной системой (терпеновое масло). При микроскопическом исследовании подсчитывали количество нейтрофилов, лимфоцитов, плазмоцитов и эозинофилов на 100 клеток. Дополнительно считали содержание в мазке макрофагов и клеток мезотелия.
Эксперименты были проведены в соответствии с правилами приказа Минвуза № 742 от 13.11.84 «Об утверждении Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Статистическую обработку результатов проводили при помощи компьютерной программы ANOVA с использованием LSD-теста.
Результаты и обсуждение
Влияние пептидов PGP, PG и GP (3,7 мкмоль/кг) на степень экссудации и цитологический состав (лейкоцитарную формулу) брюшного экссудата крыс
Предварительное введение пептидов не влияло на количество экссудата, в опытной и в контрольной группах его обLем был почти одинаков.
В экссудате животных, получивших PGP, PG и GP, снижалось на 14 % относительное количество нейтрофилов по сравнению с контролем (рис. 1а); наблюдалась тенденция к увеличению лимфоцитов (рис. 16); почти в 3,3 раза увеличивалось содержание эозинофилов (рис. 1г). На плазмоциты достоверно влияли PGP и GP, вдвое увеличивая их количество (рис. 1е). Во всех опытных группах, практически отсутствовали макрофаги (рис. 13) и мезотелий (рис. 1е).
Лейкоциты формируют в организме человека мощный кровяной и тканевой барьеры против микробной, вирусной и паразитарной инфекций, поддерживают тканевой гомеостаз и регенерацию тканей, первыми реагируют на повреждение. При перитоните активизируются нейтрофильный и макрофагальный компоненты естественной неспецифической защиты организма, а эозинопения в активной фазе заболевания или в послеоперационном периоде часто свидетельствует о тяжести процесса и является неблагоприятным признаком.
Уменьшение числа нейтрофилов и макрофагов в экссудатах животных, получивших PGP, PG и GP, говорит о меньшей воспалительной реакции в зоне ульцерогенеза. Эозинофилия на фоне действия всех трех пептидов соответствует началу выздоровления.
Разные субпопуляции лимфоцитов выполняют различные функции: обеспечивают эффективный клеточный иммунитет или формируют гуморальный ответ. В-лимфоциты посредством выделения цитокинов участвуют в регуляции иммунного ответа и координации работы всей иммунной системы в целом, также эти клетки связаны с обеспечением иммунологической памяти. Но основная функция В-клеток заключается в том, чтобы в ответ на антиген размножаться и дифференцироваться в плазматические клетки, продуцирующие антитела. Зрелые плазматические клетки способны синтезировать несколько тысяч иммуноглобулинов в секунду. PGP и GP увеличивали количество плазмоцитов в 2 раза, что свидетельствует о влиянии этих пептидов на пролиферацию и дифференциацию В-лимфоцитов. PG имел такую же тенденцию.
В последнее время образование язв в желудке, нередко сопровождающее стресс-реакцию организма, связывают с нарушениями в иммунной системе, в первую очередь, со снижением активности В-лимфоцитов. Известно, что иммунонормализующие препараты обладают противоязвенным эффектом [6].
Таким образом, высокая противоязвенная активность PGP и GP, возможно, связана с вовлечением В-лимфоцитов в защиту от ацетатного и стресс-индуцированного язвообразования.
Влияние пептидов PGP, PG и GP (3,7 мкмоль/кг) на соотношение белковых фракций крови крыс при остром перитоните
Уровень белка в норме (у интактной крысы) составил 64 г/л (альбумины 27,9 и глобулины 36,13 г/л) (рис. 2а). При перитоните количество общего белка у контрольных крыс, получавших предварительно физиологический раствор, уменьшилось на 23 %.
Рис. 1. Влияние пептидов PGP, PG и GP (3,7 мкмоль/кг) на цитологический состав брюшного экссудата крыс
а) — нейтрофилы; б) — лейкоциты; в) — плазмоциты; г) — эозинофилы; д) — макрофаги; е) — мезотелий. * p <0,05, ** p <0,01 к контролю. Количество животных в группах «контроль», «PGP», «PG» и «GP» — 9, 9, 9 и 8, соответственно.
Альбумины и глобулины снижались примерно одинаково (рис. 26). Глипролины, практически не влияя на абсолютные значения альбуминов и глобулинов, изменяли относительное, процентное содержание отдельных фракций глобулинов. У контрольных животных с перитонитом значение класса а:-глобулинов, состоящего в основном из острофазных белков, повышалось примерно на 33 % по сравнению с нормой. GP практически возвращал уровень а1-глобулинов к норме, PGP и PG имели такую же тенденцию (рис. 2е). Фракция а2-глобулинов, включающая в себя, преимущественно, противовоспалительные и противоинфекционные, а также транспортные белки, достоверно уменьшалась в контроле по сравнению с нормой на 35 %. На фоне предварительного введения PGP и PG значения этих белков были выше по сравнению с контролем на 26 % и 44 %, соответственно (рис. 2г). Р-глобулины (трансферрин, гемопексин, компоненты комплемента и бета-липопротеиды) у контрольных животных имели тенденцию к снижению, PGP и GP еще больше снижали их уровень (рис. 23). Количество у-глобулинов (иммуноглобулинов) при перитоните у контрольных животных увеличилось на 80 %. Их содержание в группах PGP и GP было более повышенным по сравнению с контролем (рис. 2е).
Рис. 2. Влияние пептидов PGP, PG и GP (3,7 мкмоль/кг) на соотношение белковых фракций крови крыс при перитоните
*** p < 0,001 к контролю. Количество животных в группах а1- , а2- , ?- и у-глобулинов — 3, 5, 4, 5 и 5, соответственно.
Противовоспалительный эффект глипролинов при остром перитоните
Итак, у животных после внутрибрюшинного введения уксусной кислоты наблюдалась гипопротеинемия, характерная для перитонита, однако на фоне действия пептидов у крыс с перитонитом немного, в отличие от контроля, повышался уровень острофазных белков, а на фоне введения GP они практически оставались в норме. О меньшей степени воспаления также свидетельствует приближающееся к нормальному уровню содержание противовоспалительных и транспортных белков в группах животных, получавших PGP и PG. Несколько повышенное содержание иммуноглобулинов в сыворотке животных, которым ввели PGP и GP, соответствует описанным выше результатам — увеличенному по сравнению с контролем количеству плазмоцитов в соответствующих группах.
Абрамова М.А., Самонина Г.Е., Ашмарин И.П. Пролин и простейшие про- линсодержащие фрагменты нейропептидов модулируют через центральные и периферические механизмы состояние слизистой оболочки желудка // Нейрохимия. — 1996. — Т. 13, № 3. — С. 209-214.
Бакаева З.В., Самонина Г.Е. Глипролины уменьшают развитие и ускоряют заживление ацетатных язв у крыс // Патол. физиол. эксп. тер. — 2005. — № 2. — С. 25-27.
Жуйкова С.Е., Бакаева З.В., Самонина Г.Е. Дифференцированные противоязвенные эффекты возможных метаболитов пептида PGP — PG и GP на этаноловой и стрессорной моделях вызова язв у крыс // Вестн. Моск. уни- вер. — 2003. — № 2. — Сер. 16: «Биология». — С. 20-22.
Копылова Г.Н., Смирнова Е.А., Санжиева Л.Ц. и др. Глипролины и семакс уменьшают стрессогенные нарушения микроциркуляции в брыжейке // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2003. — Т. 136, №. 11. — С. 497-499.
Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. — М.: Медицина, 1975. — С. 325-330.
Нежинская Г.И., Петрова Н.Н. Роль стимуляции В-лимфоцитов в профилактике стресс-индуцированных язв желудка крыс линии Вистар // Цитокины и воспаление. — 2006. — Т. 5. № 1. — С. 34-36.
Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Сергеев В.И. и др. Коррекция кровотока желудка как один из возможных механизмов противоязвенных эффектов коротких пролинсодержащих пептидов // Росс. физиол. ж. им. И.М. Сеченова. — 2001. — Т. 87, № 11. — С. 1488-1492.
Торопова А.А., Лубсандоржиева П.Б., Ажунова Т.А. и др. Антиоксидантная активность водных извлечений антиязвенного сбора in vitro // Сиб. мед. ж. — 2005. — № 4. — С. 45-50.
9. Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Смирнова Е.А. и др. Секреторная активность тучных клеток при стрессе — влияние пептидов пролил-глицил-про- лина и семакса // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2003. — Т. 137, № 10. — С. 371-373.
Умарова Б.А., Лелекова Т.В., Копылова Г.Н. и др. Роль протекторных эффектов пролинсодержащих пептидов (PGP, PG, GP) в нарушении сократительной функции лимфатических сосудов брыжейки при экспериментальном остром перитоните у крыс // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2006. — Т. 142, № 9. — С. 248-251.
Andersson K., Mattsson H., Larsson H. The role of gastric mucosal histamine in acid secretion and experimentally induced lesions in the rats // Digestion. — 1990. — Vol. 46, № 1. — P. 1-9.
Bregonzio C., Armando I., Ando H. et al. Anti-inflammatory effects of angiotensin II AT1 receptor antagonism prevent stress-induced gastric injury // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. — 2003. — Vol. 285. — P. 414-423.
Ito А., Nagase H., Mori Y. Characterization of metalloproteinases in rat gastric tissues with acetic acid — induced ulcers // Scand. J. Gastroenterol. — 1989. — Vol. 162. — P. 146-152.
Tarnawski A., Holander D., Stachura J. et al. Vascular and microvascular changes — key factors in the development of acetic acid-induced gastric ulcers in rats // J. Clin. Gastroenterol. — 1990. — Vol. 12. — P. 148-157.
Samonina G., Lyapina L., Kopylova G. et al. Protection of gastric mucosal integrity by gelatin and simle proline-containing peptides // Pathophysiology. — 2000. — Vol. 7. — Р. 69-73.
Our previous experiments showed that glyprolines - Pro-Gly-Pro (PGP), Pro-Gly (PG) and Gly-Pro (GP) - reduced the formation and accelerated healing of gastric ulcers caused by application of ice acetic acid on the rat stomach mucosa. Considering that the formation of the acetic acid-induced gastric ulcers in rats includes strong inflammatory process, the purpose of the work was to investigate the anti-inflammatory properties of PGP, PG and GP peptides using experimental model of inflammation. Acute peritonitis caused in albino male rats by i. p. injection of 1 % acetic acid was accompanied by exudative reaction, migration of active blood cells in exudation, with prevalence of neutrophils. The biochemical analysis of blood revealed a change in parity of albuminous fractions characteristic of inflammation. Previous i. p. introduction of PGP, PG or GP in a dose of 3.7 ^mol/kg led to a decrease in neutrophil content in exudation in comparison with the control and to increase in eosinophil and plasmacyte contents. The levels of al- and a2-globulins became near normal. The results suggest that PGP, PG and GP have an anti-inflammatory effect in experimental peritonitis that may be responsible for anti-ulcer effect of glyprolines. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 2. P. 28-32.)
